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H2O
Nuovo Arrivato
32 Messaggi |
 Inserito il - 03 marzo 2009 : 16:48:46
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Ciao a tutti
ho un problema urgente: e sono alle prese con estrazioni di acidi nucleici da tessuti...il mio scopo è quello di estrarre DNA e per far ciò ho utilizzato fenolo, però nella PCR non ottengo quello che voglio! perchè? 
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 03 marzo 2009 : 16:59:15
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Forse dovresti spiegarci meglio la situazione... "non ottengo quello che voglio" non è molto informativo, soprattutto perchè non sappiamo cosa vuoi!
Non ottieni proprio DNA? Non riesci ad amplificare un gene di interesse?
In generale non c'è bisogno di usare fenolo/cloroformio per estrarre il DNA, puoi fare una semplice precipitazione con isopropanolo. |
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H2O
Nuovo Arrivato
32 Messaggi |
Inserito il - 03 marzo 2009 : 17:17:51
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non ottengo l'amplificato desiderato....è come se non ci fosse DNA. però l'estrazione la faccio col metodo di sacchi, conoscete?
c'è un esperto in biologia molecolare? |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 04 marzo 2009 : 02:44:24
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Prova anche a seminare il DNA genomico su gel di agarosio e vedere se e' presente e se e' integro o degradato.
Se li hai utilizza anche altri primers per un altro gene come controllo.
Se la lettura allo spettrofotometro ti dice che il DNA e' contaminato e' possibile anche riprecipitarlo. |
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H2O
Nuovo Arrivato
32 Messaggi |
Inserito il - 05 marzo 2009 : 10:42:58
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| non ci siamo ragazzi....penso non abbiate capito il mo problema! un esperto biologo molecolare lo avrebbe già centrato....grazie comunque. |
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miky76
Utente Junior
126 Messaggi |
Inserito il - 05 marzo 2009 : 11:18:46
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ecco l'esperto in biologia molecolare
ma scusami ma credo che tu nn abbia spiegato il problema!!!!
dici che hai DNA, ma che non ottieni il prodotto desiderato
quindi deduco che ottieni un prodotto...quindi il tuod DNA e' ben estratto
se poi fai una pcr di controllo con un gene di riferimento tipo GAPDH
allora sei certo che il tuo DNA e' ok
puoi anche metterlo su gel ma quello che ottieni e' solo una banda molto grande... quindi nn te lo consiglio
quindi mi dici che problema dovremmo centrare?
che la tua PCR non funziona.... quindi nn e' un problema di estrazione
ma solo che i tuoi primers non funzionano come dovrebbero
allora se vuoi una mano... dicci esattamente cosa sta succedendo e non essere ermetico perche' forse non tutti sono esperti di biologia molecolere
ma non bisogna essere esperti per fare una estrazione di DNA e una PCR!!!!!!
buona giornata
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Dionysos
Moderatore
Città: Heidelberg
1913 Messaggi |
Inserito il - 05 marzo 2009 : 11:45:45
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Citazione:
non ci siamo ragazzi....penso non abbiate capito il mo problema! un esperto biologo molecolare lo avrebbe già centrato....grazie comunque.
quoto miky76
Quel che ci vorrebbe è semmai un esperto in parapsicologia
per leggerti nel pensiero, visto che ancora non sei stato in
grado di spiegare il problema. Estrarre DNA e farci PCR è una
attività basilare e qui di esperti ne troverai tantissimi, ma
prima di tutto bisogna che tu sappia spiegare quello che fai.
Sapersi spiegare è fondamentale, altrimenti nessuno ti può aiutare
nemmeno il più esperto fra gli esperti. |
Volere libera : questa é la vera dottrina della volontà e della libertà
(F.W. Nietzsche)
Less Jim Morrison, more Sean Morrison!
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 05 marzo 2009 : 11:48:15
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Sinceramente se tu dici:
Citazione:
non ottengo l'amplificato desiderato....è come se non ci fosse DNA.
Io continuerò a risponderti, all'infinito:
Citazione:
Se fai una lettura allo spettrofotometro a 260 nm c'è del DNA?
Poi, io magari non sono un esperto di biologia molecolare, ma penso che decisamente GFPina la potremmo qualificare come tale. |
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H2O
Nuovo Arrivato
32 Messaggi |
Inserito il - 05 marzo 2009 : 13:04:43
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| conoscete qualcuno nella comunità che sappia qualcosa in più? qualche personaggio mi sembra di averlo già visto....ma non ricordo il nome! un certo giovanni.... |
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miky76
Utente Junior
126 Messaggi |
Inserito il - 05 marzo 2009 : 13:21:22
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ciao
al posto di chiarire quale problema hai
chiedi se conosciuamo qualcuno che sappia qualcosa in piu!
ti dico solo che ho un dottorato con massimo di voti in biologia molecolare conseguito in una universita' europea di massimo livello
pensa che tu nn voglia essere aiutato
in bocca al lupo e la prossiam volta rivolgiti ad un premio nobel
forse lui sa qualcosa in piu e sapra' aiutarti!
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cin
Utente Junior
Prov.: Padova
Città: Padova
558 Messaggi |
Inserito il - 05 marzo 2009 : 13:28:07
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| Secondo me H2O è una ragazza che è semplicemente in cerca di Giovanni, sa che bazzica sul forum e non sa un fico secco di biologia molecolare! Sbaglio forse? |
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H2O
Nuovo Arrivato
32 Messaggi |
Inserito il - 05 marzo 2009 : 13:39:30
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| ragazzi ho fatto la lettura allo spettro e non c'è DNA....quindi? |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 05 marzo 2009 : 13:46:55
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Quindi il problema è nell'estrazione e non nella PCR, il che è già un'ottima cosa da sapere.
Un paio di domande:
1) da che tessuto parti e in che quantità?
2) è fresco o congelato?
3) esattamente come procedi per l'estrazione? (ok, con il metodo di Chomczynski e Sacchi, ma dicci un po' più precisamente gli step che fai, magari c'è un errore banale nel protocollo che usi)
4) hai provato a usare il protocollo che ti ho indicato sopra? Lo uso spesso e non mi ha mai dato problemi. |
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H2O
Nuovo Arrivato
32 Messaggi |
Inserito il - 05 marzo 2009 : 14:00:13
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il tessuto è cervello, congelato ma non posso dire altro! sono ermetico perchè non posso dire di più, sennò poi mi copiate le cose, scusate!
vabbè metto il fenolo, agito un pò, poi il cloroformio....ecc. se conoscete sacchi sapete tutto quello che si fa
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Patrizio
Moderatore
Città: Barcellona
1912 Messaggi |
Inserito il - 05 marzo 2009 : 14:31:42
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| H2O fossi in te mi farei consigliare da giovanni..non mi fido di loro |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 05 marzo 2009 : 15:29:30
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Beh se hai paura che ti copino  allora non fare domande su Internet (anche se come ricercatore trovo questa attitudine poco produttiva).
Personalmente mi piacerebbe tantissimo trovare il tempo per copiarti gli esperimenti... ma sono troppo preso con i miei. |
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H2O
Nuovo Arrivato
32 Messaggi |
Inserito il - 05 marzo 2009 : 15:30:47
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Citazione:
Messaggio inserito da Patrizio
H2O fossi in te mi farei consigliare da giovanni..non mi fido di loro
anche tu hai la mia stessa sensazione? mmmmm......giovanni dove sei?
ma io cerco in internet x sapere delle risposte che si possono dare anche non rivelando tutto l'esperimento.
cmq ripeto, è come se il DNA non venisse estratto.... |
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Giuliano652
Moderatore
Prov.: Brescia
6940 Messaggi |
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dallolio_gm
Moderatore
Prov.: Bo!
Città: Barcelona/Bologna
2445 Messaggi |
Inserito il - 05 marzo 2009 : 15:48:44
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io sono un Giovanni e bazzico questo forum... pero' non credo che tu ti riferisca a me, non ne so mezza di biologia molecolare!!
Posso dire pero' che le persone che ti hanno risposto sono molto in gamba (leggiti gli altri topic per fartene una idea)
lascio la parola agli altri Giovanni (non so quanti ce ne siano, su questo forum) |
Il mio blog di bioinformatics (inglese): BioinfoBlog
Sono un po' lento a rispondere, posso tardare anche qualche giorno... ma abbiate fede! :-) |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 05 marzo 2009 : 16:03:12
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Rispondo solo a miky76:
Citazione:
Messaggio inserito da miky76
puoi anche metterlo su gel ma quello che ottieni e' solo una banda molto grande... quindi nn te lo consiglio
Certo vedresti una banda molto grande che fa fatica ad uscire dal pozzetto, è proprio questo il punto! Se vedi questo il DNA è integro, se invece vedi uno smear è degradato.
La lettura allo spettrofotometro sinceramente la davo per scontata! |
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miky76
Utente Junior
126 Messaggi |
Inserito il - 05 marzo 2009 : 16:18:58
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ciao GFPina
si... sinceramente pensavo che avesse fatto una lettura del DNA prima di procedere con la PCR...
inoltre poiche' aveva scritto che nn otteneva il prodotto desiderato
avevo assunto che un prodotto lo otteneva
se no bastava scrivere.. non ottengo la PCR
quindi avevo sconsigliato il gel perche'bisogna veramente impegnarsi a degradare un DNA con una semplice estrazione!!!
ma si conscordo con te che se il DNA e' degradato... esce dal pozzetto come una smirata
ma ripeto pensavo che avesse fatto la lettura e che aveva DNA sporco
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H2O
Nuovo Arrivato
32 Messaggi |
Inserito il - 05 marzo 2009 : 17:02:21
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Citazione:
Messaggio inserito da dallolio_gm
io sono un Giovanni e bazzico questo forum... pero' non credo che tu ti riferisca a me, non ne so mezza di biologia molecolare!!
Posso dire pero' che le persone che ti hanno risposto sono molto in gamba (leggiti gli altri topic per fartene una idea)
lascio la parola agli altri Giovanni (non so quanti ce ne siano, su questo forum)
non sei tu...ce l'ha scritto nel suo nik, ma forse sono solo le iniziali.
non metto in dubbio che siano in gamba, ma dalle risposte di pina e quell'altro sono proprio fuori strada....speriamo mi illumini presto qualcuno! |
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Patrizio
Moderatore
Città: Barcellona
1912 Messaggi |
Inserito il - 05 marzo 2009 : 17:17:35
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una prova pratica della fuga dei cervelli !
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 05 marzo 2009 : 17:22:18
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| Va bene, allora facciamo così. Se Giovanni legge questo messaggio ti può scrivere in privato, così gli puoi confidare i tuoi segreti. Nel frattempo io chiudo questa discussione così siamo tutti più felici. |
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