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astrea84
Nuovo Arrivato

2 Messaggi

Inserito il - 13 marzo 2009 : 09:40:58

ciao raga sn nuova del forum...mi kiedevo quale fosse il metodo migliore per raccogliere le cellule per fare poi l'estrazione di proteine...in genere le stacco con la tripsina quando faccio estrazione di rna...lo posso fare anche per le proteine o le raccolgo in PBS e con lo scraper? la resa � la stessa?? nn mi interessano proteine di membrana...ciao grazie

Giuliano652
Moderatore

Prov.: Brescia

6940 Messaggi

Inserito il - 13 marzo 2009 : 09:50:33

io lo facevo con lo scraper, tanto alla fine le devi lisare per estrarre le proteine, no?

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Iside
Utente Attivo

Citt�: Napoli

1375 Messaggi

Inserito il - 13 marzo 2009 : 10:12:41

anche io a volte uso lo scraper per� il problema � che quando raccogli in PBS e poi centrifughi per pellettare (prima di lisare con un buffer) potresti perdere del materiale perch� lo scraper � un metodo abbastanza aggressivo, molte cellule si rompono e le proteine vanno in soluzione quindi saranno perse con le centrifughe. Se hai una buona resa proteica per� questo � trascurabile. Altro metodo e lisare direttamente nel pozzetto con il sample buffer caldo. in pratica metti il SB e poi con un puntale muovi andati e indietro sul pozzetto. in questo modo non perdi niente, e i campioni sono gi� pronti per essere caricati.

...we're just two lost souls swimming in a fishbawl...year after year...

mattia.dinunzio
Nuovo Arrivato

116 Messaggi

Inserito il - 13 marzo 2009 : 11:07:59

io personalmente preferisco staccare le cellule (vedi te se con scraper o tryp. in base a quel che ha detto iside), pellettarle e poi aggiungere un buffer di lisi. generalmente uso il cellytic della sigma con inibitore di proteasi se devo fare poi del WB. in alternativa puoi pellettare e rompere le cellule in PBS con un omogenizzatore. cosi sei sicura che (anche se non avrai rese elevatissime) non siano presenti interferenti con i saggi successivi.
ciao

astrea84
Nuovo Arrivato

2 Messaggi

Inserito il - 21 marzo 2009 : 12:14:02

ciao grazie a tutti per avermi risposto!!