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silvietta82
Utente Junior
126 Messaggi |
 Inserito il - 13 novembre 2009 : 17:00:38
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Ciao a tutti. Qualcuno mi sa spiegare come funzionano in real time PCR le sonde TaqMan e l'intercalante Siber Green. grazie
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 13 novembre 2009 : 17:42:31
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Hai provato a cercare sul forum, ci sono varie discussioni, ad es. queste:
http://www.molecularlab.it/forum/topic.asp?TOPIC_ID=2184&SearchTerms=SYBR,Green
http://www.molecularlab.it/forum/topic.asp?TOPIC_ID=4939&SearchTerms=SYBR,Green,Taqman
http://www.molecularlab.it/forum/topic.asp?TOPIC_ID=973&SearchTerms=SYBR,Green,Taqman
http://www.molecularlab.it/forum/topic.asp?TOPIC_ID=4339&SearchTerms=SYBR,Green,Taqman
http://www.molecularlab.it/forum/topic.asp?TOPIC_ID=883&SearchTerms=SYBR,Green,Taqman
P.S. si scrive "SYBR Green", l'ho corretto nel titolo. |
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silvietta82
Utente Junior
126 Messaggi |
Inserito il - 13 novembre 2009 : 18:22:32
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| Si avevo già guardato sul forum, ma non ho trovato nulla di generale su come funzionano teoricamente queste "sonde" durante la real time...o meglio, su TaqMan qualcosa ho trovato e in linee molto generali ho capito, ma su SyberGreen, oltre al fatto che si intercala al DNAds in modo aspecifico (cioè a tutto e non solo quello che voglio amplificare) e qsa su una melting curve (di cui ora nn mi sto interessando), non trovo il meccanismo generico con cui consente di quantificare il DNA durante una real time. Comunque ora controllo anche i link che m i hai mandato, magari trovo altre info che mi erano sfuggite, ti ringrazio :-) |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 13 novembre 2009 : 18:59:06
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Più DNA hai più SYBR Green si intercalerà più fluorescenza hai.
Siccome i tuoi primer sono specifici per il tuo gene puoi dire che l'aumento di fluorescenza durante la realtime è dovuto all'amplificazione del tuo gene.
Simile discorso per le Taqman, solo che sono ancora più selettive per il tuo gene di interesse (e non sono intercalanti). |
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toolll
Nuovo Arrivato
15 Messaggi |
Inserito il - 14 novembre 2009 : 01:06:15
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velocemente,
Taqman, richiede l'utilizzo di sonde oligonucleotidiche con doppia marcatura, un fluorocromo (di solito si usano Vic e Fam) e una molecola "Quencer" o "spegnitore".
La sonda è specifica per la sequenza che ho intenzione di studiare, per cui inizialmente si attacca ad essa e resta lì immobile senza emettere nessun segnale. Quando la polimerasi comincia la fase di estensione del Primer, l'attività 5' nucleasica dell'enzima degrada la sonda, questo avvenimento porta al rilascio del fluorocromo, il quale non essendo più vicino alla molecola "Quencer" emette una fluorescenza, per cui i prodotti di amplificazione sono direttamente proporzionali al segnale di amplificazione.
Il segnale di amplificazione consiste in una curva sigmoidea, ed in base a controlli che utilizzo imposto la linea soglia del segnale.
La real time puo' essere utilizzata per diverse reazioni. ti faccio un esempio pratico così più chiaro:
voglio fare una descriminazione allelica, mettiamo di un SNP, per cui quello che farai è utilizzare 2 sonde che legano la stessa sequenza, ma che differiscono per due cose:
-la marcatura sonda per lo SNP "A" vic e "G" fam
- ovviamente il complementare sulla sonda per lo SNP da indagare
per cui in caso di eterozigote per quel polimorfismo si avranno sia segnale vic che fam,
in caso di omozigosi solo un segnale, o vic, o fam.
cosa servono i controli? cosa sono questi controlli?? non sono altro che campioni che hai genotipizzato con metodica diretta certa, come il sequenziamento, pr cui conosci permettamente che campione x è omozigote e y eterozigote.
Prima di eseguire la real time, prendi tipo 10/20 campioni, fà il sequenziamento, e ad esempio ottieni 4 omo dom. 4 etero e 2 omo rec, per cui prendi in tutte le analisi sucessive che effettuerai 1 di ogni tipologia 1 omo dom 1 etero e 1 omo rec, e li genotipizzi ogni volta con real-time con il resto dei nuovi campioni, avendo quei tre campioni sai in modo preciso dove posizionare la linea di threshold per verificare la fluorescenza. questo è un breve riassunto. ovviamente esistono anche interi libri che parlano solo di "REAL-TIME",,, |
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