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susanna pilichi
Nuovo Arrivato
3 Messaggi |
 Inserito il - 03 dicembre 2009 : 18:09:17
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ciao a tutti.
Devo fare un'ibridazione in situ usando una sonda biotinilata e rivelando il segnale in 2 modi, uno successivo all'altro. Il 1° consiste in una rivelazione di tipo enzimatico usando il sistema perossidasi-DAB-H2O2; il secondo si basa sull'impiego di extravidina coniugata con fluorocromo.
Il dubbio è questo: nel primo metodo di rivelazione posso usare un'extravidina coniugata con perossidasi, alla quale far seguire la DAB?
Inoltre, c'è qualcuno che mi sa dire dove posso trovare una spiegazione (schematica o scritta) CHIARA della reazione tra perossidasi e H2O2-DAB? Ho cercato in diversi siti, ma talvolta la DAB viene definita come substrato, tal'altra il substrato è rappresentato dall'H2O2. Per farla breve, poche idee ma confuse in merito!!!
Grazie.
Ciao Susanna
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 03 dicembre 2009 : 18:28:53
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L'H2O2 è il substrato della perossidasi. La reazione porta alla formazione di radicali che ossidano la DAB.
Per il problema delle sonde non ho capito... vuoi rilevare la stessa sonda in due modi? Per quale motivo?
Nota che benchè DAB+fluorescenza sia fattibile, non è il max... la DAB tende ad abbassarti molto il segnale in fluo. |
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susanna pilichi
Nuovo Arrivato
3 Messaggi |
Inserito il - 04 dicembre 2009 : 10:02:22
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proprio ora ho trovato che il Maniatis (Molecular cloning: a laboratory manual. 3rd edition) dice che la DAB è il substrato della perossidasi....mah! Ho idea che al riguardo ci siano diverse correnti di pensiero. Comunque, bando alle speculazioni "filosofiche" e andiamo al dunque.
Per quanto riguarda la doppia rivelazione, la voglio eseguire in 2 steps separatiper la seguente ragione: il 1° step con la DAB mi serve per visualizzare la "struttura" del tessuto (nel mio caso cartilagine articolare ed osso subcondrale di un condilo femorale di pecora) mediante la colorazione di contrasto con ematossilina, al fine di localizzare esattamente la posizione del segnale positivo nel suo contesto. Dopo montaggio in medium acquoso e fotografia del risultato, procederò allo smontaggio del coprioggetto, seguito da lavaggi in acqua distillata per rimuovere il cromogeno (almeno credo!!?)e da incubazione con extravidina coniugata con TRITC e controcolorazione con DAPI.
Questo procedimento l'ho appreso da un collega, ma non sono entrata a fondo nei dettagli, per cui alcuni passaggi rimangono un pò oscuri. Ad esempio, non ho capito bene cosa dilavo dopo lo smontaggio del coprioggetto: se elimino l'extravidina coniugata con perossidasi, nel passaggio successivo metterei ad incubare il campione con una nuova extravidina, questa volta coniugata con TRITC.
A questo aggiungi che sono una neofita del campo, per cui ho anche delle carenze personali. Proprio per questo, ogni consiglio è bene accetto.
Cosa intendi quando dici che la DAB abbassa il segnale fluo? Ti riferisci al mio caso, in cui eseguirò 2 steps di rivelazione separati o cosa?
Spero di non essere stata troppo confusionaria... |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 04 dicembre 2009 : 13:41:07
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Intendo dire che se fai sullo stesso tessuto in contemporanea un marcaggio DAB + fluo, il segnale fluorescente è di solito un po' meno intenso
Non so darti una ragione precisa, penso che la DAB possa interferire (forse facendo da quencher???) ti parlo più per esperienza personale.
Se hai delle fettine seriali potresti farne 1/2 con DAB e 1/2 con fluorescenza no? Ti risparmi anche lo smontaggio. |
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