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Discussione |
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uxux
Nuovo Arrivato
5 Messaggi |
 Inserito il - 30 giugno 2010 : 19:29:36
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Ciao a tutti.
Sto facendo delle pcr di genotipizzazione a partire dal dna genomico estratto dalla coda di topi.
Mi sta capitando però di avere il bianco sporco, ovvero su gel vedo amplificato (della stessa altezza del mio gene di interesse). Il problema è che osservo tutte le norme di sicurezza:
lavoro sotto cappa a flusso laminare, utilizzo puntali con filtro e preparo la mix cin reagenti puliti (nel senso che anche usasndo reagenti tutti nuovi e acqua sterile ri-autoclavata, ho avuto qst problema!)In pratica preparo la mix, cambio i guanti, aliquoto il dna (rigorosamente con una pipetta che si usa solo per il dna e non per gli altri reagenti della mix), dopo aver aliquotato il dna, cambio nuovamente i guanti e aliquoto la mix, stando attenta a tenere chiusa la provetta del bianco (che faccio per ultima)che apro solo prima di metterci la mix.
Sto diventando paranoica, ma non funziona lo stesso. Ho ottenuto un bianco pulito solo una volta, dopo aver cambiato lo stock madre dei primers (che aliquoto). secondo voi che succede???
aspetto consigli suggerimenti.
grazie
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
 Inserito il - 30 giugno 2010 : 20:01:25
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Hai cambiato il loading buffer e pulito le pipette che usi per caricare il gel?
Generalmente per la genotipizzazione non servono tutte queste misure "di sicurezza"... |
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uxux
Nuovo Arrivato
5 Messaggi |
Inserito il - 30 giugno 2010 : 20:05:07
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si il buffer si, le pipette di carimento no. Ma il bianco è uguale alla mia banda amplificata.....non so cosa possa essere, ma credo che il problema sia nel momento in cui aliquoto la mix...forse avendo tanti campioni, in media 50, è possibile che in qualche modo possa contaminare????
cambio sempre puntale, ma ormai non so più che fare...
grazie per l'aiuto e i suggerimenti...
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
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uxux
Nuovo Arrivato
5 Messaggi |
Inserito il - 30 giugno 2010 : 20:13:21
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io estraggo il dna da topi che abbiamo in colonia, per stabilire se sono wt, he o ko per il mio gene di interesse. utilizzo la pcr per amplificare la banda di interesse (130 pb) e poi sottopongo i prodotti di amplificazione a digestione enzimatica. non ho mai provato a digerire il bianco contaminato, magari da li potrei capire dove contamino??
potrebbe essere un problema di pipettamento??
non saprei davvero cosa altro pensare..
tu che ne pensi?
grazie |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 30 giugno 2010 : 20:22:21
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No, scusa, mi sono spiegato male.
Intendevo dire: a parte l'acqua, la banda contaminante ce l'hai sia nei KO che nei wt? Ed è la banda corrispondente al tuo gene di interesse o qualcosa d'altro?
Prova magari a cambiare/pulire le pipette, poi non mi viene in mente che altro potresti cambiare. |
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SpemannOrganizer
Utente
Città: Los Angeles
955 Messaggi |
Inserito il - 30 giugno 2010 : 20:28:42
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| come già anticipato da chick, potrebbero essere le pipette. puliscile e/o usa puntali con filtro |
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uxux
Nuovo Arrivato
5 Messaggi |
Inserito il - 30 giugno 2010 : 20:30:40
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ahahahah bellissima....
hai consigli tu sul mio problema?
grazie |
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Gabriele
Utente
Prov.: Pisa
Città: Pisa
615 Messaggi |
Inserito il - 30 giugno 2010 : 23:17:32
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| Non sarà che quando pipetti nel gel esce un pò di campione e va a contaminare il bianco? |
"Chi rinuncia alla libertà per la sicurezza, non merita né la libertà né la sicurezza. E finirà col perdere entrambe." |
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uxux
Nuovo Arrivato
5 Messaggi |
Inserito il - 30 giugno 2010 : 23:33:06
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no, lo escludo visto che il bianco su gel lo carico tra 2 pozzetti vuoti.....
avresti altre supposizioni a riguardo???
grazie |
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Gabriele
Utente
Prov.: Pisa
Città: Pisa
615 Messaggi |
Inserito il - 01 luglio 2010 : 18:41:19
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| La vaschetta dove fai l'elettroforesi forse.....potrebbe essere contaminata? Cambi sempre il liquido? |
"Chi rinuncia alla libertà per la sicurezza, non merita né la libertà né la sicurezza. E finirà col perdere entrambe." |
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virga84
Nuovo Arrivato
6 Messaggi |
Inserito il - 19 luglio 2010 : 14:36:31
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Una domanda..... quando si lavora con Dna i puntali con filtro vanno sempre usati oppure si possono usare le punte autoclavate???
Scusate se la domanda nn è al 100% attinente con questa discussione... ma nel mio lab c'è una diatriba ormai da mesi tra me e una mia collega che continua a dirmi che i puntali col filtro nn servono a nulla e quindi basta usare quelli autoclavati, mentre a me è da sempre stato detto di usare solo quelli col filtro per ridurre eventuali contaminazioni.... voi cosa ne pensate?? |
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mak_steon
Utente Junior
138 Messaggi |
Inserito il - 19 luglio 2010 : 15:15:03
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I puntali col filtro riducono sicuramente il rischio di contaminazione, questo è sicuro.
Poi però non è detto che uno debba per forza usare quelli. Io ad esempio non li uso praticamente mai e l'unica volta che ho avuto problemi di contaminazione non era dovuto alle pipette.
Ciao |
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virga84
Nuovo Arrivato
6 Messaggi |
Inserito il - 19 luglio 2010 : 15:24:00
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| grazie |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 19 luglio 2010 : 15:34:40
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| Io per caricare i risultati del genotipaggio uso anche puntali non autoclavati, e non ho mai avuto problemi. Ovvio, è una situazione in cui la banda c'è o non c'è ed è molto chiaro se il campione è positivo, quindi posso prendermi questa "libertà" :) |
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SpemannOrganizer
Utente
Città: Los Angeles
955 Messaggi |
Inserito il - 19 luglio 2010 : 15:37:12
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| io pure li usavo i puntali col filtro un tempo. ora nn li usiamo più ma nn ho avuto grossi problemi di contaminazione, giusto due casi sporadici che rientrano nei casi di errori da distrazione. |
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H2O
Nuovo Arrivato
32 Messaggi |
Inserito il - 20 luglio 2010 : 18:17:46
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| ma non è che il risultato dei tuoi campioni è negativo e magari le bande che vedi sono relative ai tuoi primers? |
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virga84
Nuovo Arrivato
6 Messaggi |
Inserito il - 20 luglio 2010 : 22:57:27
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| le bande dei primers nel caso si troverebbero non allo stesso pm del suo campione |
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-maddy-
Nuovo Arrivato
Città: cagliari-torino
50 Messaggi |
Inserito il - 23 luglio 2010 : 22:16:03
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Ciao!
se ti può servire, anch'io ho avuto a lungo il problema del bianco nonostante le pipette pulite, puntali col filtro, camice monouso (addirittura) etc etc...perchè lavoro su un gene che è oggetto di studio nell'istituto che mi ospita da parte di tutti..e dunque diciamo che "è nell'aria", nel tessuto del mio stesso camice
;-)...ad oggi l'ho risolto aliquotando la mix in una cappa dedicata, dentro la quale è severamente vietata l'introduzione di cDNA....sotto la stessa dunque preparo la mix comune ai miei campioni e al bianco (usando cmq accorgimenti tipo: primers, MgCl2, buffer, dNTPs, DMSO, H2O e la stessa Taq aliquotati in aliquote se possibile monouso), poi metto i micolitri di mix/campione nei tubini (ovviam anche nel bianco) e chiudo tutto...il bianco va diretto nel termociclatore ad aspettare il resto dei campioni che porto sotto 1 altra cappa dove (previa espozione agli uv) aliquoto il mio cDNA...finalmente chiudo tutto e viaaa!!!
E' una procedura da paranoica, però ho risolto definitivamente il problema...
In bocca al lupo, ciao! |
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cami
Utente Junior
Città: roma
136 Messaggi |
Inserito il - 02 agosto 2010 : 12:16:37
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domandina: visto che si sta parlando di PCR contaminate, mi potreste aiutare a togliermi un dubbio?
ultimamente sto lavorando molto con real time PCR, quindi dopo l'estrazione dell'RNA e la retrotrascrizione faccio una PCR di verifica del 18S, per vedere se la RT è andata a buon fine e per escludere contaminazioni... normalmente stresso molto le condizioni, per ricalcare quelle della real time, ovvero arrivo a fare anche 37 - 40 cicli di PCR. fino a qualche tempo fa non avevo nessun problema, ma ultimamente vedo comparire una debole banda nel controllo senza RNA, esattamente all'altezza del mio amplicone (112 bp), e assente nei no RT e no DNA. non escludo che fosse presente anche prima, ma essendo debole magari mi sfuggiva, perchè non capisco da cosa possa dipendere: ho cambiato tutto e poi tutto ancora (pipette, puntali, postazione, provette, adirittura termociclatore, e ovviamente tutti i reagenti) ma continuo a vedere la banda malefica. ho anche notato che se riduco i cicli a 30, magicamente la banda sparisce, perciò mi domando: è davvero una cosa preoccupante o è una sorta di artefatto dovuto al fatto che stresso troppo le condizioni? lo chiedo perchè anche in real time ho notato che il controllo negativo del normalizzatore tende ad amplificarsi verso la fine della reazione, ma mi è stato detto che se ci sono almeno 10 cicli di differenza tra il Ct dei campioni e quello del controllo negativo non è preoccupante... è vero?
come sempre, qualsiasi suggerimento, ipotesi e opinione è assai gradita... grazieeeeeeeee!!!!  |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 02 agosto 2010 : 12:42:21
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Beh facendo una PCR end-point a 40 cicli è abbastanza comune vedere un po' di amplificato nel bianco, piccolissime contaminazioni che ci possono essere vengono per l'appunto "amplificate".
La real-time viene portata fino a 40 cicli per essere sicuri di raggiungere bene la fase di plateau in tutti i campioni, ma i cicli a cui fai l'analisi, "fase lineare", sono molto più bassi. E come dici tu a volte anche in real-time si vede uscire qualcosa nei bianchi attorno al 40mo ciclo, ma non è nulla di preoccupante. |
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PCR 
Didattica
