Buffer estrazione proteine nucleari

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_pietro_
Nuovo Arrivato

Citt�: Lund

104 Messaggi

Inserito il - 09 settembre 2010 : 14:56:33

Ciao a tutti,

sono alle prese con un saggio enzimatico per la misura dell'attivita' delle DNA-metil-trasferasi. Le prime esperienze sono state abbastanza sconfortanti. Poi realizzo che richiedono che le proteine siano estratte (da tessuti) in un buffer che contenga un massimo di 100mM NaCl, quando il mio buffer e' 400mM.

La domanda che mi sono posto e' se basta che io abbassi la concentrazione di sale. Il fatto e' che il NaCl serve per procurare una sorta di shock osmotico e fare in modo che ma membrana nucleare ceda e rilasci le proteine. Per cui non vorrei rischiare.

Ad ogni modo: qualcuno di voi e' in possesso di una ricetta del genere?

Grazie

miRNA_dangerous
Nuovo Arrivato

18 Messaggi

Inserito il - 09 settembre 2010 : 21:28:11

Forse con tutto quel sale ti si denatura la proteina. Io proverei a diluire il tuo buffer di 4 volte, cos� non variano i rapporti tra i componenti del buffer...e ritento l'operazione...

_pietro_
Nuovo Arrivato

Citt�: Lund

104 Messaggi

Inserito il - 10 settembre 2010 : 11:13:57

Interessante ;)
Comunque non credo che mi si denaturi, ho gia' provato questo protocollo per analisi di western blot e funziona. Il problema puo' essere che il saggio enzimatico (o l'attivita' stessa della proteina) vada a farsi benedire con quel sale..

Ad ogni modo grazie ^^