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thejoint84
Nuovo Arrivato



46 Messaggi
Inserito il - 27 maggio 2011 : 15:19:14  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di thejoint84 Invia a thejoint84 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Salve a tutti,
la mie condizioni sono: E.coli, trasformazione per eletroporazione. Voglio inserire un frammento di PCR...
Io ho usato due ceppi, resi competenti lo stesso giorno allo stesso modo, trasformati con lo stesso frammento di PCR lo stesso giorno, insomma condizioni identiche... Uno si é trasformato ed il frammento di DNA si é integrato, l´altro nulla....
Nel protocollo mi dice di usare tutte cose fredde e di risospendere l´elettroporato in 2 ml di LB freddo prima di far crescere 1.5h a 37°C. Puó essere che qualche minuto in ghiacchio dopo l´elettroporazione in qualche modo favorisca?????
Grazie in anticipo!!!
http://cornermolecularbiology.blogspot.com/

immetella
Nuovo Arrivato

Dory

Prov.: Pescara
Città: Pescara


32 Messaggi
Inserito il - 31 maggio 2011 : 16:15:10  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di immetella Invia a immetella un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ciao! Premetto che non sono espertissima ma ho fatto spesso elettroporazione di E.coli per inserire plasmidi....nel mio protocollo era specificato di asciugare bene le cuvette (anche se fredde perchè precedentemente tenute in ghiaccio) prima di elettroporare, infatti se saltavo questo passaggio l'elettroporatore faceva un bruttissimo rumore! Tra l'altro poi ci dovrebbe essere un modo nel tuo elettroporatore per vedere l'efficienza di trasformazione (io ricordo che premevo un tastino e mi diceva l'efficienza che se era di un valore intorno a 1.80 era ok).Prova a cercare un manuale per l'elettroporazione e la prossima volta a controllare l'efficienza.
in bocca al lupo!
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thejoint84
Nuovo Arrivato



46 Messaggi
Inserito il - 02 giugno 2011 : 17:46:49  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di thejoint84 Invia a thejoint84 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Io uso 2.50 di pulse e i millisecondi di solito stanno intorno ai 5.....
Il mio supervisor m´ha detto che per questi ceppi uropatogenici che usiamo ci vuole un pó di pazienza perché l´efficienza di trasfezione é piú bassa rispetto a K12 per esempio.... cmq le cose stanno andando avanti e ogni tanto esce qualcosina di buono (per fortuna)...
Grazie per il suggerimento...il fatto di asciugare le cuvette non lo avevo mai sentito...ma faró attenzione la prossima volta (domani).....
http://cornermolecularbiology.blogspot.com/
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