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mastro
Nuovo Arrivato
Città: Genova
5 Messaggi |
 Inserito il - 06 febbraio 2012 : 22:54:53
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Buona sera a tutti!!!!
Sto affrontando alcune difficoltà nel comprendere come siano costruiti i microarray, in particolare cosa venga considerato come probe, cosa come probe set e come spot.
in particolare mi sono soffermato sugli Affymetrix Hggu133 plus 2, con 54.000 trascritti analizzabili in expression profiling.....ma il dato cosa rappresenta:
1) il fatto che io possa inserire 54.000 geni diversi (strano, dato che al momento se ne conoscono 30.000 ca);
2) il numero di trascritti/messaggeri che posso andare a ricercare;
La sicurezza sta nel fatto che le probe singole siano sequenze di cDNA, cRNA, prodotti PCR, long/short-mers etc... però le stesse sono raccolte in probe set, che a loro volta sono presenti in 11 o più copie in maniera da raccogliere informazioni precise sul trascritto in esame.
Spulciando in rete ho recuperato alcune informazioni che all'apparenza mi sono sembrate utili:
il parametro di densità calcolato con la distanza centro-centro di due spot
- D=100x(1000/dimensione spot)x2 --> genera la densità degli spot su cm^2
- generalmente gli spot hanno diametro (forse solo per i Pat Brown) di 150 micron, per cui - la formula di cui sopra risulta: D=100x(1000/150)x2 = 1.333,333 spots/cm^2
- con un chip da 1,28 cm di lato ho una superficie di 1,63 cm^2
- per cui --> 1.333,333 x 1,63= 2.133,333 spots totali
...... 
Ora cominciano i problemi....non riesco a racapezzarmi!!!
Qualche anima pia può indicarmi un muro dove abbattermi....o darmi un buon motivo per andare a zappare!!!!
Grazie mille anticipatamente!!!!!
Attendo delucidazioni!!
Ciao ciao
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La Maona |
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Moloney
Nuovo Arrivato
111 Messaggi |
Inserito il - 06 febbraio 2012 : 23:31:24
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Non ho capito quali sono i tuoi dubbi, di preciso. Comunque, per quanto riguarda gli arrays affymetrix:
Per prima cosa non confondere i trascritti con i geni. Un gene può avere più trascritti (isoforme), dunque capisci come circa 30.000 geni possano generare ben più di 30.000 trascritti.
Seconda cosa: i probes affymetrix sono SEMPRE oligo DNA, di circa 25 nucleotidi. 11 probes (in altre versioni può cambiare questo numero) differenti costituiscono 1 probe set. Ogni trascritto può essere interrogato da 1 o più probe sets.
Il metodo di costruzione dell'array affymetrix non è spotting. E' un metodo fotolitografico di costruzione dell'oligo "bottom-up". I probes si trovano idealmente all'interno di quadrati di circa 11 um di lato (anche questo numero può cambiare in base al chip affymetrix).
Spero di aver chiarito almeno uno dei tuoi dubbi! :D |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
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mastro
Nuovo Arrivato
Città: Genova
5 Messaggi |
Inserito il - 06 febbraio 2012 : 23:51:15
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Grazie per la risposta!
Allora, il dubbio principale riguarda semplicemente quanti spot ho su un microarray e, di conseguenza, cosa ci carico all'interno (uso la prima persona singolare, ma immagino che lo faccia una macchina :) ), dato che uno schema preciso di come sia fatto un microarray non lo ho ancora trovato. Il dubbio è sorto a lezione, durante la quale il tecnico ha nominato indistintamente probes e probe set, unitamente a geni e trascritti....una confusione ben palpabile!! :D
Ok per le differenze di fabbricazione, evidentemente non le distinguo a dovere. 
Per cui, se i 54.000 sono trascritti, avrò almeno 11 probes per ognuno, cioè 1 probe set per trascritto..... cioè 54.000x11=594.000 probes.....
Gli spot, allora, che contengono di preciso? Ognuno è un probe set???
Leggendo un bugiardino sul sito affy ogni probe set è indicato come contenente 1x10^4 probes 25-mers........ Non mi tornano i conti |
La Maona |
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mastro
Nuovo Arrivato
Città: Genova
5 Messaggi |
Inserito il - 06 febbraio 2012 : 23:56:06
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| ah....ok, ho riletto bene il commento... Affy non è spotted |
La Maona |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 07 febbraio 2012 : 00:01:15
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Una probe (=sonda) è una sequenza complementare alla sequenza che stai cercando. Siccome queste probes sono corte (es. 25-mers) ne potrai disegnare più di una per ogni gene (es. una all'inizio, una a metà, una alla fine, etc). In questo modo anche se hai del binding aspecifico con una sonda, è poco probabile che tu l'abbia anche con tutte le altre. L'insieme di tutte le sonde per un certo gene è un probe set.
Ora, su ogni quadratino del tuo microarray, mica ci metti solo una copia di ogni probe, altrimenti il segnale sarà troppo debole. Quindi ogni probe del probe set di un gene sarà ripetuta più volte (non conosco i valori precisi, ma da quanto scrivi evidentemente sono 10^4 probes per spot / 11 probes per gene ~= 900 copie di ogni probe).
Se hai probes per 54000 trascritti su un chip vuol dire che avrai un totale di 594000 probes diverse (ciascuna ripetuta ~900 volte) ovvero 10^4 * 54000 = 540 milioni di 25-mers. |
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Moloney
Nuovo Arrivato
111 Messaggi |
Inserito il - 07 febbraio 2012 : 01:06:23
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Allora, nel dettaglio più di 54000 sono i probe sets, nel chip che dici tu.
Con quel chip si possono interrogare 38500 geni ben caratterizzati nelle diverse banche dati. 54000 probe sets e circa 1.300.000 probes. Perchè così tanti e non perchè 594000 (54000 x 11)? Semplice, perché non ti è stato detto che in realtà si parla non di 11 probes per probe set, ma di 11 probe pair per probe set. Ovvero, per ogni sonda PERFECT MATCH 25-mer disegnata sul gene, è disegnata una sond MISMATCH quasi uguale alla prima (con 1 mismatch all'interno, però) che servirà per calcolare il segnale di eventuale legame aspecifico. |
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mastro
Nuovo Arrivato
Città: Genova
5 Messaggi |
Inserito il - 07 febbraio 2012 : 01:22:22
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Perfetto!!! Grazie mille per le spiegazioni, ora sto integrando con un altro pdf dal sito di Affy e le cose sembrano tornare....
Un dubbio è stato colmato......tra un pò spunteranno fuori anche gli altri...
Torno a studiare....Grazie mille ancora!!! Probabilmente vedrete comparire altri post a mio nome....non sparatemi!!
Buona serata
Ciao ciao |
La Maona |
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