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chiapas84
Nuovo Arrivato
14 Messaggi |
 Inserito il - 18 ottobre 2012 : 14:26:20
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Salve a tutti, mi chiedevo se sul forum ci fossero persone che hanno dimestichezza con questa tecnica.
Praticamente la settimana prossima inizierò con la messa a punto di un protocollo per l'ibridazione in situ su sezioni in paraffina utilizzando una sonda DNA marcata con digossigenina. Le mie perplessità sono sul buffer di ibridazione. Praticamente al momento non mi è possibile reperire "salmon sperm dna" e "yest transfer RNA". Sfogliando diversi protocolli in rete ho trovato che in realtà entrambi gli additivi sono enhancer dell'ibridazione. A questo punto vi chiedo se, secondo la vostra esperienza, il non includere nel buffer tali reagenti influirà troppo negativamente sulla riuscita dell'ibridazione. Grazie anticipatamente per le risposte, a presto.
ADM
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zerhos
Utente Junior
Prov.: Pisa
Città: Pisa
421 Messaggi |
Inserito il - 19 ottobre 2012 : 20:17:39
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| La mia preoccupazione non è tanto il buffer di ibridazione quanto il fatto che userai sezioni incluse in paraffina. Non che in paraffina le ish non vengano, ma sono molto molto più difficili rispetto a tessuti inclusi in oct e tagliati al criostato (che in genere è lo standard per chi fa ISH su sezioni). I due componenti di cui parli te generalmente aiutano parecchio la riuscita dell'ibridazione ed eliminano molto il segnale di fondo. Per precauzione ti consiglio di usare un controllo negativo dove far ibridare il complementare della sonda (ovvero il trascritto stesso). Nel controllo non dovresti ottenere nessun segnale specifico e nello stesso tempo ti fai un idea del possibile segnale di fondo che potrà venire fuori. |
"l'unica differenza tra me e un pazzo è che io non sono pazzo!"
Salvador.Dalì
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SpemannOrganizer
Utente
Città: Los Angeles
955 Messaggi |
Inserito il - 21 ottobre 2012 : 06:06:48
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Esistono ottimi protocolli per le in situ su paraffina, almeno in situ per mRNA.
Per quanto riguarda i reagenti salmon sperm and yeast tRNA, concordo con zerhos: sono molto importanti per ridurre il fondo quindi è meglio utilizzarli. |
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chiapas84
Nuovo Arrivato
14 Messaggi |
Inserito il - 22 ottobre 2012 : 11:15:37
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Grazie a tutte per le risposte. Si, per quanto riguarda la preoccupazione sulle sezioni in paraffina, ho letto anche io diverse problematiche in proposito. Il protocollo che proverò a mettere a punto è tratto dal libro "In situ Hybridization protocols - Ian A. Darby". In questo libro si parla di un'ottima riuscita della ISH su sezioni in paraffina, trattando le sezioni con pre-trattamento combinato microonde-proteinasi K. I due componenti del buffer di cui sopra, non possono essere sostituiti con qualcosa di alternativo?
Cordiali saluti,
ADM. |
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chiapas84
Nuovo Arrivato
14 Messaggi |
Inserito il - 22 ottobre 2012 : 21:19:41
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| Ho recuperato il "salmon sperm dna"..ora l'unico additivo che verrebbe a mancare è lo "yeast tRna".. |
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