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nickdumb
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7 Messaggi |
 Inserito il - 05 dicembre 2012 : 15:52:40
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salve, dovrei cominciare a mettere a punto il protocollo per l'isolamento dei monociti da sangue. Per far questo vorrei utilizzare del sangue congelato, giusto per far delle prove! che ne pensate?
grazie mille!
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jerne
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9 Messaggi |
 Inserito il - 06 dicembre 2012 : 15:20:51
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 Scritto da MolecularLab Mobile
Decisamente meglio partire da un prelievo fresco (10 ml), diluire 1:2 in PBS il sangue trattato con un anticoagulante e stratificarne delicatamente 5 ml su 5 ml di Ficoll a densità 1.77, avendo cura di non rimescolare. Centrifugare 30 minuti a 800xg (in centrifughe standard circa 2.000 rpm). Eritrociti e granulociti sedimentano sul fondo, una banda contenente linfociti e monociti (80%/20% rispettivamente) si forma all'interfaccia tra plasma e Ficoll. Da qui, a seconda delle disponibilitàs economiche, è possibile purificare i monociti con diversi metodi: 1) adesione in piastra di Petri in terreno di coltura, 1ora a 37 gradi, i monociti aderiscono, i linfociti restano in sospensione. Prima di fare l'adesione, è bene lavare un paio di volte le cellule a bassa velocità per eliminare le piastrine. 2) uno dei tanti sistemi immunomagnetici, avendo cura di usare anticorpi contro la popolazione che NON si vuole purificare, per ottenere i monociti mediante sottrazione, allo scopo di non attivarli. |
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jerne
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9 Messaggi |
Inserito il - 06 dicembre 2012 : 15:21:56
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Scritto da MolecularLab Mobile
Densità 1,077 ovviamente! (Errore di battitura) |
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nickdumb
Nuovo Arrivato
7 Messaggi |
Inserito il - 06 dicembre 2012 : 23:20:23
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ovviamente i metodi immunomagnetici non ce li possiamo permettere :D
l'anticoaugulante uno vale l'altro oppure si deve usare una provetta specifica?
Intanto grazie!! |
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sarmirna
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8 Messaggi |
Inserito il - 09 gennaio 2013 : 11:35:38
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| l'anticoagulante dipende dal tipo di analisi che devi poi fare sui monociti. Inoltre valuta bene quanti monociti ti occorrono.I monociti sono il 10% dei PBMCs totali, quindi 10 ml di sangue vanno benissimo per una prova, ma per lavorarci su forse occorre un po di sangue in più. |
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