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BotryGen
Nuovo Arrivato
8 Messaggi |
 Inserito il - 24 settembre 2013 : 17:15:25
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Ciao a tutti, è molto che vi seguo e devo dire che in più di un'occasione siete stati molto utili.
Adesso però è il caso di qualcosa di molto specifico.
La problematica è questa: voglio produrre 4 proteine ricombinanti in batteri e non ci riesco.
Ho inserito in pET-28 la mia CDS oppurtunamente modificata con i vari tag per la purificazione, ho trasformato batteri BL21, li ho fatto crescere come da protocollo, ho indotto con IPTG e raccolto a tempo 0, dopo 1h, 3h e 5h da induzione, ma nulla è stato prodotto. Non soo non vedo la bandona tipica in SDS-page, ma anche il western mi dice che non c'è nulla.
Allora ho cambiato vettori e ho provato con pRSF-Duet e pACYC-Duet sempre in BL21 e nulla anche questa volta.
Adesso ho messo su un'altra trasformazione della stessa "proteina" nei 3 vettori (pET-28, pRSF e pACYC), ma in BL21-DE3 detti anche "Rosetta".
Vedremo come viene, ma se non mi viene nulla neanche così?
Che faccio?
Dove sbaglio?
Avete qualche consiglio?
Se vi servono più dettagli non avete che da chiedere.
Grazie mille a tutti!!!
PS: ovviamente dopo inserimento nei vari vettori della mia CDS ho sequenziato e tutto è giusto!
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là
Utente Junior
565 Messaggi |
 Inserito il - 24 settembre 2013 : 17:45:27
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Ho visto che il pET-28 ha il promotore T7, e le BL21 non sono indicate per questo tipo di promotore. Sono le BL21(DE3) ad usarlo. Potrebbe essere questo il problema |
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BotryGen
Nuovo Arrivato
8 Messaggi |
Inserito il - 25 settembre 2013 : 10:24:11
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Mi sono informato ed ho scoperto che le BL21 che usavo, effettivamente erano le BL21(DE3)...
Adesso spero davvero sia un problema che risolverò con le Rosetta...
Altrimenti non so proprio dove sbattere la testa!! |
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là
Utente Junior
565 Messaggi |
Inserito il - 25 settembre 2013 : 12:05:11
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Hai provato a vedere se la tua proteina ha dei codoni rari?
In questo caso le Rosetta dovrebbero risolvere il tuo problema. Hai anche provato a vedere se la tua proteina è nei corpi inclusi? |
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