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 RT-PCR - cDNA lettura nanodrop e scelta concentrazione
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Daniele430
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6 Messaggi

Inserito il - 15 settembre 2014 : 15:23:35  Mostra Profilo Invia a Daniele430 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Salve ragazzi vorrei che qualcuno mi illumini. Ho un campione di RNA misurato al nanodrop con una conc di 500ng/ul, ora vorrei retrotrascrivere 1ug per ottenere il cDNA. Ora la domanda è per caricare una conc di 100ng/ul di cDNA sulla piastra per la PCR, leggo quest'ultimo al nanodrop? Utilizzo la concentrazione di 500ng/ul di RNA di partenza? Oppure parto dal presupposto che amplifico 1ug per cui alla fine della retrotrascrizione avrà circa 1000ng/ul di retrotrascritto? Grazie a tutti per le risposte

GFPina
Moderatore

GFPina

Città: Milano


8380 Messaggi

Inserito il - 17 settembre 2014 : 10:44:00  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Il cDNA non lo puoi quantificare al Nanodrop perchè non è puro. Nella tua soluzione avrai anche dNTPs non incorporati e RNA (integro o degradato) che influiscono sulla lettura.
In genere quello che si fa è partire sempre dalla stessa quantità di RNA per fare la retrotrascrizione, fare la retrotrascrizione nelle stesse condizioni e basarsi su quella per fare la real-time.

Ora... ammettendo che la resa della retrotrascrizione sia 100% tu da 1ng di RNA otterrai 1ng di cDNA, non 1000ng/ul come dici tu, a meno che tu non abbi fatto la RT in 1ul, cosa che vedo un po' improbabile.
Citazione:
Oppure parto dal presupposto che amplifico 1ug per cui alla fine della retrotrascrizione avrà circa 1000ng/ul di retrotrascritto?


Quello che si fa comunque è:
- partire dalla stessa quantità di RNA
- retrotrascrivere (sempre allo stesso modo)
- usare la stessa quantità (volume) di cDNA ottenuto in tutte le real-time successive
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