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 100 bp DNA ladder Invitrogen
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Lory_biotech
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3 Messaggi

Inserito il - 21 novembre 2014 : 11:10:12  Mostra Profilo Invia a Lory_biotech un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ciao, ho ricevuto questo ladder, 50 ug totali e concentrazione 1 ug/ul. L'ho diluito 1:10 (tot 500 ul) e aggiunto loading dye 10X (50 ul). Sul manuale viene indicato di caricare 0,5 ug/lane. Ho caricato quindi 5 ul su un gel 1%, corso circa 20 minuti 100V in buffer TAE 1X (stesso usato per dissolvere l'agarosio) ma le bande del ladder non si sono aperte in maniera decente (vedi file allegato). Stavo pensando di aumentare la percentuale del gel all' 1.5% almeno, e aumentare il tempo di corsa a 30 min...
Suggerimenti?
Ah per visualizzare le bande uso SYBRSafe.

Grazie!

Allegato: 141120 colony PCR.pdf
115,8 KB

midichloria
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75 Messaggi

Inserito il - 21 novembre 2014 : 11:27:06  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di midichloria Invia a midichloria un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Di che ladder si tratta? A me sembra un po' troppo concentrato. Comunque la percentuale del gel dipende anche molto dal tipo di frammenti in questione. Se stai analizzando frammenti di dimensione superiore alle 500 bp, un gel allo 0.8-1% Ú pi˙ che sufficiente.
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Lory_biotech
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3 Messaggi

Inserito il - 21 novembre 2014 : 13:11:24  Mostra Profilo Invia a Lory_biotech un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Il ladder e' quello che ho scritto nel titolo, 100 bp DNA ladder dell'Invitrogen... sto analizzando frammenti tra i 600 e 1000 bp
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midichloria
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75 Messaggi

Inserito il - 21 novembre 2014 : 15:33:16  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di midichloria Invia a midichloria un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ah scusa! Non avevo visto Comunque Ú molto strano.... Vedendo le bande nella foto comunque mi sembrano tanto grosse, quindi io proverei a caricare meno ladder.
Io normalmente uso Ladder ready to use, ma cercando online ho visto il foglietto del ladder e dicono anche "A final concentration of 20mM NaCl is recommended for gel electrophoresis". Il protocollo di preparazione del ladder prevedeva l'aggiunta di NaCl?

Nelle FAQs sul sito ho trovato la domanda: "Why are the DNA bands from my molecular weight ladder smearing?"
Tra le varie risposte indicano:
- Too much DNA was loaded on the gel. Decrease the amount of DNA in the gel.
- Improper electrophoresis conditions were used. Do not allow voltage to exceed ~20 V/cm. Maintain a temperature <30 degrees C during electrophoresis. Check that the electrophoresis buffer used has sufficient buffering capacity.

Prova a vedere se modificando queste cose riesci a vedere bene tutte le bande del ladder...
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Lory_biotech
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3 Messaggi

Inserito il - 21 novembre 2014 : 19:38:02  Mostra Profilo Invia a Lory_biotech un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Mah... non avevo mai aggiunto NaCl nel ladder in precedenza! Io ho diluito con acqua distillata sterile! Prover˛ a caricarne 3 ul, e comunque un tentativo con gel pi¨ concentrato lo faccio... loro la foto del ladder la danno a caricando 0.5 ug/lane, con etidio bromuro e gel 2%...
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