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 produzione eGFP da E.Coli
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Tag   GFP    Coli    purificazione  Aggiungi Tag

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radames
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1 Messaggi

Inserito il - 30 giugno 2015 : 20:50:25  Mostra Profilo Invia a radames un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ciao a tutti innanzitutto!
Sono francesco, studente di biotecnologie alle prese con un piccolo problema del quale non riesco a venire a capo.

Sto producendo, purificando e quantificando eGFP a partire da colture di E.Coli allo scopo di poterla usare come standard in modo da creare una retta di taratura che verrā utilizzata per quantificare l'espressione di eGFP in Benthamiana. (stesso principio delle rette con la BSA).

E fin qui tutto bene.

Il problema č sorto qualche giorno fa quando, andando a prendere i campioni in freezer a -20 °C, mi accorgo che hanno perso visibilmente di fluorescenza (data confermato successivamente da una lettura di fluorescenza).

Cercando di capire cosa č successo allora ho fatto una lettura spettrofotometrica del campione, risultato: uguali valori della prima volta che č stata quantificata. la protein aera quindi presente.
HO quindi fatto un estern blot per capire se fosse ancora intera o si fosse degradata col tempo e risulta essere praticamente dimerizzata.

La eGFP č risospesa nel buffer di eluizione utilizzato per la sua purificazione da colonna Ni_NTA (Sodio fosfato, pH=7.0, 50 mM e imidazolo 50 mM).

Qualsiasi consiglio o riflessione č ben accetto.

Grazie mille a tutti quanti!
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