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Tag   clonaggio    enzimi di restrizione    PCR  Aggiungi Tag

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xika987
Nuovo Arrivato

CittÓ: Napoli


4 Messaggi

Inserito il - 18 dicembre 2015 : 11:56:08  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di xika987 Invia a xika987 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Salve a tutti, non so se questa sia la sezione adeguata per questo problema ma sono disperata e ci provo.
Sto cercando di clonare 11 geni, 3 dei quali non gc rich e 8 gc rich.
Ho amplificato con successo questi 11 geni, e sto utilizzando un sistema di clonaggio pettopo 100.
Ho seguito ogni fase del protocollo,utilizzando pcr "fresche" e ho purificato da gel le bande per evitare aspecifici. In nessun caso,tranne che in uno gc rich ho ottenuto la positivitÓ delle colonie (ho testato un gene non gc rich e 4 gc rich) ovvero,ho ottenuto cloni su piastra solo nell'unico gene non gc rich.
Posto che il problema sia questo, ho fatto varie colony per screenare i campioni e ho ottenuto il mio inserto. Poi ho fatto delle miniprep su inoculi fatti dalla piastra e ho rifatto la pcr; ho riottenuto l'amplificato. Per˛ ho provato a tagliare con diversi enzimi di restrizione (a coppie o in singolo, a singolo e a doppio taglio ecc) ma dalle dimensioni Ŕ come se l'inserto non fosse presente. Ho ripetuto lo stesso procedimento con altre colonie, ho rifatto la procedura con lo stesso iter ma il risultato Ŕ sempre lo stesso. Ora, prima di sequenziare i campioni,secondo voi Ŕ possibile provare qualche altra strada? Grazie mille!


Utente Junior



565 Messaggi

Inserito il - 18 dicembre 2015 : 16:25:21  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di lÓ Invia a lÓ un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Interessante, anche io facendo pcr da colonia vedo l'inserto che mi interessa dopo il clonaggio ma quando faccio le digestioni di prova non vedo l'inserto e il vettore sembra vuoto...
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GFPina
Moderatore

GFPina

CittÓ: Milano


8380 Messaggi

Inserito il - 18 dicembre 2015 : 17:52:57  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Boh, mai successo!
Comunque provo a spararne qualcuna...
non Ŕ possibile che si generino pi¨ frammenti della stessa lunghezza, e quindi le bande co-migrano?
Il sistema di clonaggio Ŕ direzionale o no? Il frammento pu˛ essere inserito in senso inverso?
Magari si forma un nuovo sito di restrizione.

Ma per la colony PCR che primers utilizzi, dove sono localizzati?
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xika987
Nuovo Arrivato

CittÓ: Napoli


4 Messaggi

Inserito il - 18 dicembre 2015 : 21:27:54  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di xika987 Invia a xika987 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Grazie per le risposte!Il sistema Ŕ direzionale e i primers coprono tutta la sequenza,dall'atg allo stop(se Ŕ questo quello che intendi per localizzazione) per il resto non saprei..penso per lo pi¨ che risolveremo con il sequenziamento a questo punto...ormai le ho provate tutte!
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