Forum

Nome Utente:
Password:
Riconoscimi automaticamente
 Tutti i Forum
 Laboratorio
 Biologia Molecolare
 Analisi di restrizione dei plasmidi ricombinanti
 Nuova Discussione  Nuovo Sondaggio Nuovo Sondaggio
 Rispondi Aggiungi ai Preferiti Aggiungi ai Preferiti
Cerca nelle discussioni
I seguenti utenti stanno leggendo questo Forum Qui c'č:

Tag   clonaggio    plasmidi ricmbinanti    taglio enzimatico  Aggiungi Tag

Quanto č utile/interessante questa discussione:

Autore Discussione  

Donni
Nuovo Arrivato



1 Messaggi

Inserito il - 23 febbraio 2019 : 18:44:14  Mostra Profilo Invia a Donni un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ciao a tutti,
sono nuova di questo forum (mi sono iscritta proprio oggi) ma lo consulto spesso per trovare risposte ai miei problemi scientifici. Sono una dottoranda ed in questo momento avrei bisogno di qualche consiglio sul clonaggio. Il mio problema č questo: avevo un clone che tuttavia si esprimeva poco (la relativa proteina era una flebile banda sul gel sds!) per cui mi č stato consigliato di spostarlo in un un altro vettore. Ho sottoposto il clone a taglio enzimatico, purificato il frammento e l'ho utilizzato per la ligation. In seguito a trasformazione, ho ottenuto colonie su piastria e le ho proceduto con lo screening. Ho fatto una colony pcr usando i primer dell'inserto e un'altra usando i primer del vettore. In entrambi i casi ho ottenuto la banda del peso atteso. A questo punto, dopo aver fatto una miniprep, prima di mandare a sequenziare (nel nostro lab abbiamo qualche problemino con la ditta dei sequenziamenti!) volevo procedere con l'analisi di restrizione dell'ipotetico nuovo clone. Ho proceduto con il taglio enzimatico ma, non solo non ho nemmeno l'ombra del frammento (375 bp) ma sembra anche che ci siano due bande ad alto peso molecolare che reputo essere il vettore.
Mi sembra molto strano che il taglio enzimatico non sia avvenuto visti i precedenti risultati. Qualcuno di voi ha qualche suggerimento?


Grazie mille


Geeko
Utente

Ctenophor1.0

Cittā: Milano


1042 Messaggi

Inserito il - 24 febbraio 2019 : 11:16:12  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Geeko Invia a Geeko un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Senza l'idea della mappa del plasmide finale č difficile dare consigli pratici e utili. Di solito la cosa ideale da fare come digestioni analitiche sarebbe ricontrollare con gli stessi enzimi usati nel clonaggio che i siti ligati si siano riformati correttamente. Soprattutto poi, se possibile, usare un enzima che tagli sia internamente che esternamente all'inserto, preferibilmente che generi frammenti ben distinti a seconda dell'orientamento dell'inserto. Nel tuo caso per vedere un frammento di 375 bp dopo digestione immagino tu abbia caricato abbastanza DNA nel gel, altrimenti pur essendoci il frammento non riusciresti a vederlo. Per far un esempio pratico: se il tuo vettore č di circa 4kb e il tuo inserto č di 0.4kb, per poter visualizzare comodamente quest'ultimo dovrai caricare 10 volte il quantitativo di DNA plasmidico che di solito carichi per visualizzare lo stesso plasmide integro.


Torna all'inizio della Pagina
  Discussione  

Quanto č utile/interessante questa discussione:

 Nuova Discussione  Nuovo Sondaggio Nuovo Sondaggio
 Rispondi Aggiungi ai Preferiti Aggiungi ai Preferiti
Cerca nelle discussioni
Vai a:
MolecularLab.it © 2003-18 MolecularLab.it Torna all'inizio della Pagina