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zio
Utente Junior
Città: Napoli (IRAQ)
120 Messaggi |
 Inserito il - 31 ottobre 2007 : 10:01:12
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 ciao a tutti, il mio problema è questo:
ho dei THP-1 e devo trasformarli in macrofagi, qualcuno mi potrebbe indicare un protocollo più dettagliato da seguire?
posseggo già una sorta di prot. preso da un lavoro, che recita così:
"il differenziamento in macrofagi avviene trattando loe cellule per tre giorni con 10^7 M 1,2,5,dihydroxyvitamin D3. I macrofagi VD3-THP1 vengono staccati dalla flask (con try-edta?) lavate e messe in coltura O/N in piastra da 24 con una densità di 10^6 cellule per pozzetto in un ml di RPMI".
le THP1 mi sono arrivate in terreno contenente 2-mercaptoetanolo e il centro ne richiede l'aggiunta nel terreno per la crescita, mi chiedevo quale fosse il ruolo del merc. nella coltura.
ringrazio chiunque mi possa dare delle delucidazioni.
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zio |
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chick80
Moderatore
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zio
Utente Junior
Città: Napoli (IRAQ)
120 Messaggi |
Inserito il - 31 ottobre 2007 : 19:17:31
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grazie chick, molto utile
[quote]ciao a tutti, il mio problema è questo:
ho dei THP-1 e devo trasformarli in macrofagi, qualcuno mi potrebbe indicare un protocollo più dettagliato da seguire?
posseggo già una sorta di prot. preso da un lavoro, che recita così:
"il differenziamento in macrofagi avviene trattando loe cellule per tre giorni con 10^7 M 1,2,5,dihydroxyvitamin D3. I macrofagi VD3-THP1 vengono staccati dalla flask (con try-edta?) lavate e messe in coltura O/N in piastra da 24 con una densità di 10^6 cellule per pozzetto in un ml di RPMI".[quote/]
  per piacere, qualcuno mi dica qualcosa di più per la differenzazione in macrofagi[/b]
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zio |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
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zio
Utente Junior
Città: Napoli (IRAQ)
120 Messaggi |
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Biologist83
Nuovo Arrivato
Prov.: Roma
Città: Roma
3 Messaggi |
Inserito il - 11 novembre 2007 : 13:54:05
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Ciao Zio,
io lavoro con le THP-1 da 3 anni, e le ho sempre differenziate a macrofagi in modo molto semplice:
- aggiungere alle cellule in coltura e in sospensione ad una densità di 1 milione per ml, 100 ng/ml di PMA (phorbol 12-myristate 13-acetate) per 72 ore (miraccomando l'aggiunta del PMA deve essere fatta al buio o cmq in penombra xkè è fotosensibile, quindi anche quando le cellule vengono riposte nell'incubatore la luce deve essere spenta ed il PMA stesso va conservato avvolto dalla carta argentata
- al termine del tempo sperimentale, si effettuano 1 o 2 lavaggi e le cellule vengono risospese in terreno (tanto se hai ottenuto macrofagi sono adesi ai pozzetti quindi nn te li porti via con i lavaggi)
- ora puoi farci gli esperimenti che vuoi, in base a se devi stimolarli o recuperarli (staccandoli)
spero ti sia stato d'aiuto |
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zio
Utente Junior
Città: Napoli (IRAQ)
120 Messaggi |
Inserito il - 12 novembre 2007 : 15:04:39
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Citazione:
Messaggio inserito da Biologist83
Ciao Zio,
io lavoro con le THP-1 da 3 anni, e le ho sempre differenziate a macrofagi in modo molto semplice:
- aggiungere alle cellule in coltura e in sospensione ad una densità di 1 milione per ml, 100 ng/ml di PMA (phorbol 12-myristate 13-acetate) per 72 ore (miraccomando l'aggiunta del PMA deve essere fatta al buio o cmq in penombra xkè è fotosensibile, quindi anche quando le cellule vengono riposte nell'incubatore la luce deve essere spenta ed il PMA stesso va conservato avvolto dalla carta argentata
- al termine del tempo sperimentale, si effettuano 1 o 2 lavaggi e le cellule vengono risospese in terreno (tanto se hai ottenuto macrofagi sono adesi ai pozzetti quindi nn te li porti via con i lavaggi)
- ora puoi farci gli esperimenti che vuoi, in base a se devi stimolarli o recuperarli (staccandoli)
spero ti sia stato d'aiuto
 ho fatto ordinare subito il PMA, appena sarà disponibile metterò in pratica i tuoi preziosi consigli.
PS. nel frattempo con la D3, facendo qualche variazione al tema, qualcosa si stà trasformando. Ti farò sapere. |
zio |
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zio
Utente Junior
Città: Napoli (IRAQ)
120 Messaggi |
Inserito il - 22 febbraio 2008 : 22:44:19
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Citazione:
Messaggio inserito da Biologist83
Ciao Zio,
io lavoro con le THP-1 da 3 anni, e le ho sempre differenziate a macrofagi in modo molto semplice:
- aggiungere alle cellule in coltura e in sospensione ad una densità di 1 milione per ml, 100 ng/ml di PMA (phorbol 12-myristate 13-acetate) per 72 ore (miraccomando l'aggiunta del PMA deve essere fatta al buio o cmq in penombra xkè è fotosensibile, quindi anche quando le cellule vengono riposte nell'incubatore la luce deve essere spenta ed il PMA stesso va conservato avvolto dalla carta argentata
- al termine del tempo sperimentale, si effettuano 1 o 2 lavaggi e le cellule vengono risospese in terreno (tanto se hai ottenuto macrofagi sono adesi ai pozzetti quindi nn te li porti via con i lavaggi)
- ora puoi farci gli esperimenti che vuoi, in base a se devi stimolarli o recuperarli (staccandoli)
spero ti sia stato d'aiuto
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ciao, biologist83, scusa se ti rispondo solo adesso ma ci tenevo a farti sapere che il PMA mi è arrivato e ho fatto subito come tu mi hai consigliato seguendo le istruzioni alla lettera. ho un solo problema cioè quello che dopo il tempo prefissato ottengo un tappeto confluente (direttamente in piastre da 24 pozzetti)ma dopo il lavaggio con PBS ne perdo moltissime. Ora secondo la tua esperienza quelle che rimangono adese sono solo i macrofagi ma come faccio ad essere sicuro che siano loro dato che non ne ho mai visti prima d'ora????
scusa la mia inesperienza ma non avresti qualche foto di macrofagi per farmi rendere conto che sto differenziando?
ti ringrazio e resto in attesa di eventuali notizie.
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zio |
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iac
Nuovo Arrivato
49 Messaggi |
Inserito il - 15 febbraio 2011 : 09:15:37
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| grazie |
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Didattica e Relazioni
Inserito il - 02 novembre 2007 : 11:20:30
