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fediscola
Nuovo Arrivato
Città: bristol
10 Messaggi |
 Inserito il - 04 settembre 2008 : 00:50:44
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Salve a tutti,
sono alle prese con una clonazione di un ShRNA che codifica per il mio target under U6 promoter in un Backbone che usiamo nel mio lab per i produrre lentivirus e che porta GFP under CMV.
La strategia che sto usando e' abbastanza lineare: tagliare il mio inerto cn ECORI e il BB con MfeI (compatible ends) e' una sticky-sticky che nn dovrebbe fare problemi.
Dopo la digestione, purifico poi defosforilo il vettore, faccio correre il gel e separo le bande col DNA di competenza(le bande sono chiare e linerai del peso giusto.
POi purifico entrambi i DNA ed eseguo la ligatione con un kit dell roche...3:1; 5:1 insert/bb ratio.Trasformo in DH5a competent cells..incubo..ma nessuna colonia!!!!1
sto diventando matta, sono da piu' di un mese che faccio qsta clonazione!
avete qlche dritta?>
grazieeeeeee
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fede |
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Dionysos
Moderatore
Città: Heidelberg
1913 Messaggi |
Inserito il - 04 settembre 2008 : 14:32:16
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Ciao, qualche mese fa ho fatto un clonaggio pressochè identico (stessi siti di restrizione, stesso ceppo
batterico, stesso tipo di inserto, solo anzichè un vettore lentivirale ne ho usato uno plasmidico).
Unica cosa: non mi sono preoccupato di defosforilare, ma è riuscita lo stesso
perchè ho usato proporzioni molto più "esagerate" rispetto alle solite 3:1, 5:1.
I dati precisi non li ho qui, ma ho fatto qualcosa come 23:1, perchè partivo da
un inserto sintetico, di cui disponevo in grandi quantità (più o meno concentrate
come uno stock di oligonucleotidi per PCR, visto che li ho fatti sintetizzare come tali).
Mi è riuscito al primo colpo, quindi magari prova così. |
Volere libera : questa é la vera dottrina della volontà e della libertà
(F.W. Nietzsche)
Less Jim Morrison, more Sean Morrison!
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morgan79
Utente Junior
Prov.: Bari
143 Messaggi |
Inserito il - 07 settembre 2008 : 19:09:21
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la clonazione l'hanno fatta per la pecora dolly
per questo clonaggio quoto dionysos, essendo lo shDNA abbastanza breve dovresti diluire ulteriormente il prodotto da ligare, anche io, come dionysos, son partito da oligo sintetici che li ho anilati, disegnati in maniera tale che recassero già le estremità coesive
in bocca al lupo |
il sapere non è sufficiente, bisogna applicare; il volere non è sufficiente, bisogna fare |
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fediscola
Nuovo Arrivato
Città: bristol
10 Messaggi |
Inserito il - 07 settembre 2008 : 22:42:19
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Grazie dell'aiuto ad entrambi..
la clonazione e la pecora dolly nn l'ho capita..
comunque ho ripetuto per l'ennesima volta tutta la reazione dall'inizio cambiando un po' le proporzioni...6:1 e 9:1 per ligare un quantitativo max di DNA che nn eccedesse i 200ng/ug totali.
Poi ho usato sia il kit della roche che uno chiamato MasterMix (mi pare) solo che mi sono aiutata della macchina per PCR che ha un programma dove semplicemente porta i campioni semplicemente prima a 16gradi eppoi li lascia a 4 O/N...Ho trasformato stavolta solo 1:10 di campione in Stb3 cells e con mia enorme sorpresa il mattino seguinte avevo delle colonie...!
sono ancora in fase di analisi cn enzimi di restrizione, ma incrocio le dita!
A sto punto credo che il problema era o nella ligazione o nelle cellule competenti (dh5a) che forse tanto competenti nn erano!
che dite?
grazie ancora! |
fede |
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