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miky76
Utente Junior
126 Messaggi |
 Inserito il - 21 ottobre 2008 : 10:27:54
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ciao
scusate ma sto mi serve aiuto
sto uscendo pazza per fare una maxiprep del plasmide PBudCE4.1
ho inserito un prodotto PCR in questo plasmide
ho fatto delle miniprep
e tutto ok
non ho ottenuto una crescita come altri plasmidi ma andava bene
ho usato la Zeocin come selezione
e ora che ho la mia colonia positiva e provo a fare una Maxiprer
la prima volta non e' cresciuto nulla
ho diminuito la concentrazione della Zeocin (25ug/Ml) ed e' cresciuto qualcosa ma molto poco per fare una Maxiprep
poi ho letto che questo plasmide
Ampicillin resistance gene and pUC origin for selection and maintenance in E. coli
http://www.biocompare.com/ProductDetails/366518/ProductDetails.html
cosi ho provato con ampicillina
ma non e' cresciuto nulla
e ora???? che faccio???
riprovo con Zeocin?
qualcuno ha esperienza con questo plasmide o con la Zeocin?
possibile che dopo una settimana la mia miniprep non sia buona???
ma lavorato con zeocin in batteri
grazie
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Patrizio
Moderatore
Città: Barcellona
1912 Messaggi |
Inserito il - 21 ottobre 2008 : 11:18:10
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Ciao
Ho preso la mappa del tuo vettore dal sito dell invitrogen
https://tools.invitrogen.com/search/index.cfm?searchterm=PBudCE4.1&fuseaction=search.simplesearch&navFilter=category:Vector%20Maps
e non risulta essere amp resistente,quindi io ti consiglierei di continuare con la zeocina,per sapere quanta ne devi mettere vedi su materiale e metodi di qualche articolo su pubmed o su sciece direct(ora ho poco tempo altrimenti ti darei una mano in piu' )
in oltre...come la fai la maxiprep?cioe' quanti ml metti nel brodo di coltura?
PS:io non ho mai fatto una maxiprep mi son fermato ad una midi per ora,pero' spero che insieme ad altri del sito tu riesca a trovare la soluzione
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miky76
Utente Junior
126 Messaggi |
Inserito il - 21 ottobre 2008 : 11:27:12
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grazie la mappa l'ho vista e avevo notato che non era presente la ampicillina
ma sull'altro sito era scritto che aveva ampicillina resistenza
e io ho provato
:)
metto 200ML per la maxiprep
ed e' la quantita' giusta
mai avuto problemi con maxiprep
ma mai lavorato con Zeocin
e la concentrazione della Zeocin sul manuale delle instruzioni e' 25ug/ml
per questo non so che fare
l'unica cosa che mi viene in mente e' la possibilita' che la mia miniprep sia da buttare
ma dopo una settimana???
tutto puo essere con le Zeocin
negli articoli che usano questo plasmide non dicono come fanno la maxiprep
solo dicono che usano il plasmide
che mi sembra anche logico
mah....
ora provo a mettere a crescere una mini dalla mia mini e se non cresce nulla
allora e' li il problema
grazie comunque e speriamo che qualcuno usi questo plasmide
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morgan79
Utente Junior
Prov.: Bari
143 Messaggi |
Inserito il - 21 ottobre 2008 : 13:20:59
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| di solito si hanno questi problemi a causa di alcuni kit di massiprep che utilizzano protocolli diversi a seconda che il vettore sia ad alto o a basso numero di copie, ma l'assenza di resistenza ad ampicillina é la spiegazione più logica |
il sapere non è sufficiente, bisogna applicare; il volere non è sufficiente, bisogna fare |
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Patrizio
Moderatore
Città: Barcellona
1912 Messaggi |
Inserito il - 21 ottobre 2008 : 14:25:00
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Citazione:
Messaggio inserito da miky76
metto 200ML per la maxiprep
ed e' la quantita' giusta
che sia la quantita' giusta lo lascerei dire agli esperimenti,hai provato a metterne di piu' nel medium di crescita? forse e' un plasmide low copy che in un qual modo rallenta la crescita e quindi in genere le quantita' vengono raddoppiate oltre che per la resa
Citazione:
la concentrazione della Zeocin sul manuale delle instruzioni e' 25ug/ml
si anche su questo sito porta questa quantita' Zeocin
Citazione:
l'unica cosa che mi viene in mente e' la possibilita' che la mia miniprep sia da buttare
ma dopo una settimana???
in genere gli inoculi si usano freschi
Citazione:
negli articoli che usano questo plasmide non dicono come fanno la maxiprep
solo dicono che usano il plasmide
che mi sembra anche logico
Si,ma io intendevo vedi li per vedere quanto antibiotico usano con questo vettore o con altri che conferiscono resistenza ad E.Coli con la zeomicina
cmq...secondo me alla base di tutto usa inoculi freschi,e aumenta la quantita' di batteri da mettere nella Maxiprep |
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Patrizio
Moderatore
Città: Barcellona
1912 Messaggi |
Inserito il - 21 ottobre 2008 : 14:26:26
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Citazione:
Messaggio inserito da miky76
metto 200ML per la maxiprep
ed e' la quantita' giusta
che sia la quantita' giusta lo lascerei dire agli esperimenti,hai provato a metterne di piu' nel medium di crescita? forse e' un plasmide low copy che in un qual modo rallenta la crescita e quindi in genere le quantita' vengono raddoppiate oltre che per la resa
Citazione:
la concentrazione della Zeocin sul manuale delle instruzioni e' 25ug/ml
si anche su questo sito porta questa quantita' Zeocin
Citazione:
l'unica cosa che mi viene in mente e' la possibilita' che la mia miniprep sia da buttare
ma dopo una settimana???
in genere gli inoculi si usano freschi
Citazione:
negli articoli che usano questo plasmide non dicono come fanno la maxiprep
solo dicono che usano il plasmide
che mi sembra anche logico
Si ma io intendevo di vedere li per sapere quanto antibiotico usano con questo vettore o con altri che conferiscono resistenza ad E.Coli con la zeomicina
cmq...secondo me alla base di tutto usa inoculi freschi,e aumenta la quantita' di batteri da mettere nella Maxiprep
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miky76
Utente Junior
126 Messaggi |
Inserito il - 21 ottobre 2008 : 14:37:58
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grazie
ma di solito uso inoculo rimasto da miniprep (ma con ampicillina) anche dopo un mese
e cresce benissimo tutto in maxiprep
gli inoculi con ampicillina resistono in camera fredda per almeno un mese
ho provato a raddappiare la quantita' di inoculo che metto solitamente
ma la crescita e' stata molto poco!!!
il problema e' che non trovo scritto da nessuna parte se questo plasmide e' high copy o no
ma forse con Zeocin bisogna usare inoculi frechi
ok grazie e provo a ritrasformare i batteri con il dna della mini
non ho altro!
e provo a fare tutto da capo....
sperem bene
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Anyra
Utente Junior
Prov.: Pesaro-Urbino
Città: Saltara
212 Messaggi |
Inserito il - 21 ottobre 2008 : 14:49:15
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Se la Zoeocin ha poca durata si inattiva e quindi nel tuo vecchio inoculo potrebbe essersi persa la pressione selettiva.
Prova con il fresco e magari fai prima partire i batteri in pochi ml (10 ca) quando vedi che si è intorbidito il terreno ridiluisci in 200 ml.
A volte i batteri si sentono soli e hanno bisogno di compagnia per crescere. |
Il mio Cavaliere
http://s4.battleknight.it/index.php?loc=hire&ref=OTA3NTAw |
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Patrizio
Moderatore
Città: Barcellona
1912 Messaggi |
Inserito il - 21 ottobre 2008 : 15:14:49
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| facci sapere |
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miky76
Utente Junior
126 Messaggi |
Inserito il - 21 ottobre 2008 : 16:02:27
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si credo sia l'unica esplicazione
il mio inoculo ha poca durata vitalizia
la nuova miniprep che ho messo a crescere stamattina con il vecchio inoculo
e' limpia.... non sta crescendo nulla!!!
ora provo a ritrasformare i batteri e a partire da un inoculo fresco
ma trasforamre con DNA da una mini.... e' dura
speriamo bene e vi faccio sapere domani se ho una bella maxiprep
da estrarre DNA
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moonycinzia
Utente Junior
234 Messaggi |
Inserito il - 21 ottobre 2008 : 17:56:40
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Citazione:
Messaggio inserito da miky76
si credo sia l'unica esplicazione
il mio inoculo ha poca durata vitalizia
ma trasforamre con DNA da una mini.... e' dura
speriamo bene e vi faccio sapere domani se ho una bella maxiprep
da estrarre DNA
ma no, io trasformo quasi sempre con il DNA delle mini però uso cellule ultracompetenti...
Cmq sì gli inoculi andrebbero sempre fatti freschi. Puoi provare a fare un preinoculo in 5 ml e poi fare una diluizione in 200ml. Io le maxi le faccio così! |
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Patrizio
Moderatore
Città: Barcellona
1912 Messaggi |
Inserito il - 21 ottobre 2008 : 18:05:38
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| Anch io trasformo con la mini...e le mie non sono ultra ...se usi lo shock termico stai ben attenta ai tempi,anche perche' il plasmide e' bello grande..non so il tuo inserto,magari tienilo qualche minuto in piu' in ghiaccio prima di passarlo nel bagnetto |
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miky76
Utente Junior
126 Messaggi |
Inserito il - 22 ottobre 2008 : 10:21:54
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hola a todos
si gli inoculi li uso vecchi di un mese e funzionano sempre
ma sempre inoculi di ampicillina
e di solito faccio la maxi da 50ul di inoculo della vecchia mini e funziona tutto
comunque ieri ho ritrasformato i batteri da DNA di mini
e FUNZIONA
quindi era l'inoculo che non so per quale ragione non andava piu bene
forse la Zeocin ha una durata inferiore
e io faccio la maxi direttamente dai batteri trasformati
li faccio crescere per 25 minuti in un eppendorf con 900ul di LB e no antibiotico
e poi metto tutto in 200ML di LB piu antibiotico
e funziona sempre senza problemi
grazie di tutto
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Patrizio
Moderatore
Città: Barcellona
1912 Messaggi |
Inserito il - 22 ottobre 2008 : 10:45:16
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Ook !
sono contento che sia andato tutto bene
Il fatto che tu usi inoculi vecchi non e' una regola,in oltre quando si inizia a fare qualcosa di nuovo c'e' sempre qualcosa che non va di suo,per far si che vada tutto nel miglior modo possibile a parer mio e' preferibile fare tutti i passaggi nella maniera piu' accurata possibile
Have a nice maxiprep
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metionina
Nuovo Arrivato
Città: Cambridge
45 Messaggi |
Inserito il - 22 ottobre 2008 : 12:06:01
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ciao!
io lavoro con la zeocin, non col tuo plasmide, ma con un vettore shuttle E.coli/micobatteri. Per quanto riguarda la concentrazione con E.coli ho sempre usato 25 ug/ml, e non ho mai avuto problemi di crescita. Poi io ho sempre fatto mini o midi prep, mai colture più grandi, ma anche lì non ho avuto problemi nella crescita. Di norma, comunque, preferisco usare inoculi freschi, ho come l'idea che i batteri possano essere più "attivi" e meno "stanchi"! |
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miky76
Utente Junior
126 Messaggi |
Inserito il - 22 ottobre 2008 : 12:20:36
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grazie per i consigli
usare inoculi freschi e' ottimo
ma se si impiega una settimana a capire se la colonia e' positiva o no
e se e' quella giusta
non sempre si possono usare inoculi freschi
ma gli inoculi vecchi di almeno un mese
funzionano benissimo
dipende da cosa devi fare e da quanto tempo hai a disposizione
io di solito ho poco tempo e tanto lavoro
quindi ottimizzo i tempi come posso
ma usero' inoculi freschi con Zeocin
si impara sempre in laboratorio
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moonycinzia
Utente Junior
234 Messaggi |
Inserito il - 22 ottobre 2008 : 13:43:49
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Citazione:
Messaggio inserito da miky76
grazie per i consigli
usare inoculi freschi e' ottimo
ma se si impiega una settimana a capire se la colonia e' positiva o no
e se e' quella giusta
non sempre si possono usare inoculi freschi
ma gli inoculi vecchi di almeno un mese
funzionano benissimo
dipende da cosa devi fare e da quanto tempo hai a disposizione
io di solito ho poco tempo e tanto lavoro
quindi ottimizzo i tempi come posso
ma usero' inoculi freschi con Zeocin
si impara sempre in laboratorio
per curiosità quanti ug per ul ottieni dalla maxi per un plasmide low copy e uno high copy? |
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miky76
Utente Junior
126 Messaggi |
Inserito il - 22 ottobre 2008 : 18:05:45
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quanto ottengo?
mah
io ogni volta diluisco a seconda di come si presenta un pellet
quindi non avendo una diluizione standard ma ad occhio
non so risponderti
di solito con le diluizioni del pellet che faccio
a volte diluisco in 100ul e altre in 200ul
sono sempre introno ai 2 o 3 ug a ul
ma non uso kit di estrazione
ma soluzioni fatte in casa
oppure se mi capita il kit qiagen maxiprep
lo modifico per fare la precipitazione in isopropanolo a -80C
e poi centrifugare senza passare per filtri o colonnine (che si perde tantissimo DNA)
spero di esserti stata utile
spiacente ma non posso risponderti |
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Discussione |
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PbudCE4.1 invitrogen
Didattica
