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peppe49
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 Inserito il - 26 giugno 2009 : 18:51:25
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salve a tutti,
qualcuno ha delle risposte soddisfacenti e molto dettagliate riguardo i 3 esperimenti di okazaki per dimostrare la discontinuità?
io sò che sono serviti per dimostrare
1exp la reazione di sintesi duplicativa a frammenti
2exp i frammenti hanno l'RNA legato momentaneamente al DNA
3exp se la reazione va avanti l'RNA scompare progressivamente
e rispettivamente sono stati utilizzate tecniche (se non erro)
1exp gradiente di saccarosio
2exp densità (solfato di cesio)
3exp pulse and chase
mi piacerebbe avere delle grosse delucidazioni specialmente per quanto riguarda le tecniche utilizzate.
mi accontenterei anche solo di links o bibliografia.
grazie a tutti
buon "clonaggio"
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peppe49
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 Inserito il - 28 giugno 2009 : 13:07:07
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non pensavo fosse così complicato, infatti ho trovato grosse difficoltà a cercare materiale a riguardo.
ma ci sarà qualcuno che sappia rispondere?!non tanto per le tecniche in se, ma se qualcuno è a conoscenza degli esperimenti, almeno solo commentarne i risultati, sarebbe molto importante per un mio migliore apprendimento.
grazie
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chick80
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peppe49
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Inserito il - 29 giugno 2009 : 02:16:26
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sono perfetti..e io che non c'ho pensato prima sono uno stordito.
i primi quattro sono gratuiti e li ho scaricati adesso , domani scaricherò il quinto in facoltà.
grazie per la tua pazienza..alla prossima consulenza..penso che serva sempre confrontare opinioni e lasciarsi consigliare da chi ha più esperienza.
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viodice88
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Prov.: Napoli
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41 Messaggi |
Inserito il - 10 luglio 2009 : 12:06:50
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non ho molto tempo per leggere tutti quegli articoli, l'esame è a breve,ma ancora non sono riuscita a capire quali sono gli esperimenti, qualcuno sarebbe così gentile da spiegarmeli? |
violetta iodice |
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peppe49
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Prov.: napoli
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Inserito il - 10 luglio 2009 : 13:12:11
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okazaki dimostra la discontinuità (e non la semidiscontinuità) con tre esperimenti:
I exp
dimostra che la reazione di sintesi duplicattiva è a frammenti:
infetta coli con T4 e incuba in presenza di Timidina Triziata (H^3-T). quindi segue la duplicazione di T4. preleva campioni di cellule a tempi diversi, lisa ed estrae DNA analizzandolo su un gradiente di saccarosio dal 5 al 20%. quest'analisi rileva la marcatura di frammenti a basso peso molecolare nei primi 7-30sec, poi ad alto peso molecolare a 120sec, cioè alla fine della duplicazione.
II exp
dimostra che i frammenti hanno RNA legato ai frammenti momentaneamente (cioè che RNA è un primer):
questo a differenza del primo si fa su gradiente di solfato di cesio e si preleva in un solo tempo. avremo che all'inizio della duplicazione il prodotto di sintesi ha una densità circa uguale al DNA, ma che non è tutto DNA, una piccola parte è costituita da RNA, che non compare più se trattando il campione con RNasi o sostanze alcaline come NaOH, dimostrando effettivamente che si tratta di RNA.
III exp
se la reazione va avanti la componente ad RNA scompare:
si espongono le cellule a marcatura per breve tempo, poi a precursori freddi (pulse-chase) si preleva a tempi successivi e si centrifuga in gradiente di cloruro di cesio. si nota che la densità iniziale è diversa da quella del DNA, perchè ci sono i primer di RNA, che poi spariscono alla fine della duplicazione, perchè rimossi e sostituiti dalla DNA pol I e i frammenti di DNA saldati dalla Ligasi.
questo è quanto ho capito a riguardo, sperando che sia valido.
in boca al lupo
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viodice88
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Città: casandrino
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Inserito il - 11 luglio 2009 : 16:33:17
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grazie mille  per l'aiuto e...che crepi questo lupo :) |
violetta iodice |
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viodice88
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Città: casandrino
41 Messaggi |
Inserito il - 11 luglio 2009 : 16:38:12
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| scusami peppe49 avrei un'altra domandina. nel terzo esperimento fornisco uracile marcato in modo da poter seguire l'RNA che poi sparisce? |
violetta iodice |
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peppe49
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Prov.: napoli
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Inserito il - 11 luglio 2009 : 18:48:08
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certo, UTP marcato con Timidina triziata, però ricorda che l'RNA non sparisce perchè si degrada, ma perchè viene sostiuito da DNA per opera della Polimerasi I e poi legato covalentemente dalla ligasi.
in ogni caso è un normalissimo metodo "pulse and chase".
purtroppo quella che ti ho spiegato io è solo un estrapolazione degli esperimenti eseguiti da okazaki, perchè se dovessi andare a spiegare gli esperimenti in dettaglio sarebbe molto più complicato.
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viodice88
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Prov.: Napoli
Città: casandrino
41 Messaggi |
Inserito il - 12 luglio 2009 : 16:53:05
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nono basta così..grazie mille, veramente gentilissimo 
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violetta iodice |
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peppe49
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Prov.: napoli
25 Messaggi |
Inserito il - 13 luglio 2009 : 01:45:40
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| in ogni caso ti consiglio di consultare qualcuno di più esperto, sono anche io uno studente e spesso può capitarmi di fare confusione, specialmente per quanto riguarda cose come questi esperimenti che non sono riportate su nessun testo, ma solo su articoli originali. |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 13 luglio 2009 : 08:41:11
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| Beh, gli articoli sono linkati sopra, se avete qualche problema nel comprenderli fate pure un fischio e vedremo di aiutarvi se possibile |
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peppe49
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Prov.: napoli
25 Messaggi |
Inserito il - 13 luglio 2009 : 11:33:37
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grazie chick80, penso che gli articoli vanno più che bene. mi sono serviti per chiarire un pò ciò che mi era stato spiegato al corso.
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Grön
Utente Junior
220 Messaggi |
Inserito il - 26 febbraio 2013 : 09:55:54
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Em, porto su questo thread dopo.. 3 anni e mezzo, a quanto vedo.
Il dibattito tra i due utenti e la documentazione di Chick son sicuramente preziosi, però.. Io sono duro di comprendonio e non riesco proprio a capire questi esperimenti.
Dispongo di alcune "tracce" (MOLTO caotiche) del mio docente ma non riesco a conciliarle con l'articolo (che probabilmente, essendo integrale, fornisce molti dettagli in più). In particolare volevo sapere:
Citazione:
PRIMA DOMANDA che mi pongo:
E' corretto parlare di TRE esperimenti di Okazaki, di cui:
- il primo per dimostrare una sintesi discontinua, organizzata in frammenti, del DNA;
- il secondo per dimostrare la compresenza di DNA/RNA nel corso della sintesi del DNA (con allusione al sistema "primer RNA + frammento di DNA";
- il terzo per dimostrare che nel corso del naturale processo di replicazione del DNA, la componente ad RNA sopra menzionata viene rimossa
..?
Citazione:
SECONDO QUESITO
Si parla di ceppi di E.Coli infettati con il fago T4. Ma di preciso che ruolo ha T4? Non avremmo potuto partire direttamente da E.Coli - che è comunque l'organismo "ospite" che offre l'apparato di replicazione al batteriofago?
Citazione:
TERZO QUESITO: sapevo che fosse incluso tra i traccianti radiattivi anche un dTTP con carbonio14, in particolar modo nel SECONDO Esperimento di Okazaki. Vi risulta?
Che ruolo ha rispetto al trizio - è un semplice tracciante come il trizio o ha un significato analitico differente nell'ambito di questi esperimenti? NON riesco a trovarvi un chiaro riferimento negli articoli!
Per la verità NON trovo proprio un riferimento all'RNA in nessuno degli articoli..!
Citazione:
QUARTO QUESITO
Da quel che ho capito, nel primo esperimento si adotta un semplice pulse labeling (=aggiunta di nucleotidi triziati) di durata variabile. In funzione della DURATA della somministrazione di tracciante radioattivo, si delineano diversi andamenti:
Ecco.. guardate il grafico a sinistra. NON riesco ad interpretarlo!
Sulle ascisse è indicata la "posizione" della sedimentazione del DNA - con 0 corrispondente alla parte più alta?
E quindi, ciascuna curva è relativa ad un singolo esperimento, con differenti tempi di pulse-labeling?
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Lo so che son tante domande tutte assieme, però per amore di verità, aggiungo che non son quesiti d'esame: son dubbi che mi son sorti spontaneamente alle lettura di tanto materiale (caotico).
Se non li risolvo finirò con l'imparare tutto a memoria e non è così che dovrebbe essere! :(
Confido, (tempo, voglia e disponibilità permettendo!) in un parere da parte vostra.
Saluti!
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randomcoil
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8 Messaggi |
Inserito il - 14 marzo 2013 : 17:50:41
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Ciao Gron! Anche io sono parecchio inesperto e studio bio molecolare da poco, ma potrei provare a risponderti su due quesiti. Premetto che non ho letto le reviews, che sicuramente contengono tutte le info che ti servono.
Primo. Riguardo l'infezione con il fago T4, penso possa avere diversi vantaggi. Il primo che mi viene in mente è la possibilità di sfruttare, oltre la normale duplicazione batterica, una maggiore velocità di sintesi di DNA data dalla replicazione del fago. Questo potrebbe portare a molto più DNA di neosintesi in tempi minori (può essere?- ripeto, non sono sicuro!). Inoltre nel caso T4 si comporti secondo il ciclo litico alla fine Okazaki si sarebbe risparmiato di lisare le cellule, dal momento che il batteriofago si replica fino alla morte dell'ospite. È solo qualche spunto, poi potrebbero esserci mille complicazioni su quanto ho detto.
Secondo. I grafici. Su questi sono abbastanza sicuro. L'interpretazione ti sfugge perché nell'immagine che posti tu mancano due didascalie. Sopra il grafico a SX ci va "infezione con T4 wildtype" e sopra quello a DX "infezione con T4 mutato per la DNA ligasi". Inoltre sulle ascisse come dici tu è indicata la distanza dalla sommità del tubo dove si è generato il gradiente di saccarosio, a minore distanza e quindi per valori più bassi corrispondono frammenti di dna piccoli, e viceversa per valori più alti. Si capisce allora che nel primo grafico, a sx, siccome la dna ligasi funzionava, dopo lunghi tempi, ad esempio 120 secondi, parecchi frammenti di Okazaki erano stati legati assieme, ed era significativa la presenza di radioattività in frammenti lunghi. A tempi brevi invece i frammenti erano più corti e si vede una distribuzione di radioattività maggiore sui frammenti corti. La differenza la fa il grafico a dx: nel t4 mutato la ligasi non connette i vari frammenti, e non si vede più la grande radioattività per frammenti lunghi! Così si spiega la sintesi di pochi frammenti lunghi, ovvero il prodotto della replicazione sul leading strand, e moltissimi frammenti corti prodotti dalla replicazione discontinua del filamento ritardato, lagging strand.Spero di essermi spiegato! |
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Grön
Utente Junior
220 Messaggi |
Inserito il - 18 marzo 2013 : 17:28:21
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Grazie della risposta, RandomCoil! Non me n'ero accorto! :P
Sono abbastanza sicuro sul grafico, adesso - a me interessa in particolar modo quello sulla sx. Giustamente quello a dx è diverso perché fa riferimento ad un esperimento con ligasi "difettosa", una nota che non avevo trovato!
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Purtroppo confermo che gli articoletti non fan riferimento all'RNA nè al carbonio14. Comincio a credere che i "tre esperimenti di okazaki" di fatto non siano 3, ma ci siano alcune varianti su tema che chiaramente in un corso di base non sian trattate.
Ad esempio, nel mio corso di studi questo della ligasi difettosa non è stato proprio considerato.
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Interessanti anche gli spunti sul FAGO T4! :)
Comunque grazie ancora - se scopro altro aggiornerò pure io il post.
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chiarettas
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3 Messaggi |
Inserito il - 29 novembre 2015 : 10:28:44
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ciao a tutti, capisco che è una vecchia discussione ma mi trovo a portare gli esperimenti all'esame... e sinceramente mi chiedo DOVE abbiate letto :
II exp
dimostra che i frammenti hanno RNA legato ai frammenti momentaneamente (cioè che RNA è un primer):
questo a differenza del primo si fa su gradiente di solfato di cesio e si preleva in un solo tempo. avremo che all'inizio della duplicazione il prodotto di sintesi ha una densità circa uguale al DNA, ma che non è tutto DNA, una piccola parte è costituita da RNA, che non compare più se trattando il campione con RNasi o sostanze alcaline come NaOH, dimostrando effettivamente che si tratta di RNA.
III exp
se la reazione va avanti la componente ad RNA scompare:
si espongono le cellule a marcatura per breve tempo, poi a precursori freddi (pulse-chase) si preleva a tempi successivi e si centrifuga in gradiente di cloruro di cesio. si nota che la densità iniziale è diversa da quella del DNA, perchè ci sono i primer di RNA, che poi spariscono alla fine della duplicazione, perchè rimossi e sostituiti dalla DNA pol I e i frammenti di DNA saldati dalla Ligasi.
per quello che ho letto nel secondo esperimento okazaki usa un t4 con ligasi termosensibile, dimostrando che i frammenti si accumulano e quindi dimostra il ruolo della ligasi e che i frammenti corti vengono legati insieme...ecc. o sbaglio. ma non trovo scritto dei primer. ora , se qualcuno è così cortese da dirimere il mio dubbio, ma dove sta la parte dell'ibrido rna/dna nell'esperimento originale di okazaki? a quale esperimento vi rifate ? il primo? 1967? il secondo? 1968? oppure a parti dell'esperimento complessivo? veramente c'è qualcosa che non coincide. o probabilemte mi sfugge qualcosa. oltretutto, parla sempre di DNA. .....
quello che io ho sui libri e sugli articoli invece si riassume in queste poche righe!
e di primer ad RNA neanche l'ombra.....HELP!
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chiarettas
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chiarettas
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