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stella_c84
Nuovo Arrivato
11 Messaggi |
 Inserito il - 21 ottobre 2011 : 17:11:03
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Ciao a tutti sono nuova del forum. Faccio un master in ricerca clinica in Spagna dove lavoro attualmente. Ho un problema a cui nn riesco a trovare soluzione.
Eseguendo le DNA PCR i negativi mi vengono sempre contaminati. Allora qui lavorano male perche' sullo stesso bancone dove si fanno le mix di PCR DNA e con le STESSE pipette si fa anche l'inoculo dei campioni e la precipitazione del DNA degli stessi campioni. Per cui evito di commentare su questo punto. Cmq mi hanno detto che nn posso cambiare bancone xche' uno e' riservato per la capa e l'altro nn si puo' usare. In poche pàrole devo stare li'.
Cmq spiego cosa faccio esattamente, magari e' un mio errore pero' vorrei capire e qui nessuno - anche i dottorati - mi san dare risposta.
I primers, la TAq e tutto il resto e' ottimo perche' abbiamo fatto una PCR "vuota" x testare che i reagenti fossero puliti e infatti sono puliti.
Vi spiego cosa faccio:
- Pulisco come meglio posso la postazione a dir poco contaminata e do una passata alle pipette.
- Metto guanti puliti
- Metto la carta nuova sul bancone dove mi andro' a poggiare
- Prendo la Taq, l'acqua (pulita aliquotata in eppendorf), i primers sempre aliquotati in eppendorf da 0,5 ml
- Metto tutto su un rack che e' stato da me pulito precedentemente, che e' lo stesso rack dove ci fanno anche la preciptazione del DNA x questo lo pulisco
- Poi alla fine prendo i campioni che li metto da un lato il piu' lontano possibile anche se nn ce' spazio. Cmq li allontano x sicurezza. I campioni stanno sempre in eppendorf da 1,5 ml
- A questo punto pronto tutto mi ricambio i guanti e inizio.
- Con i guanti puliti mi prendo le provettine e i tappi da PCR e ci scrivo numero etc. Le tappo subito ovviamente prima di tutto
- Preparo la MIX
- Metto la Mix nel negativo prima di tutto e chiudo il negativo e lo metto da parte
- Metto la mix nelle varie provettine
- Poi metto i campioni in ciascuna provettina chiudo e chiudo anche il rack per andare di sotto ed evitare contaminazioni (al piano sotto noi abbiamo la macchina per PCR).
- Arrivata li' in macchina metto i campioni e il negativo su un lato a parte e mando la PCR. Mi assicuro che suia tutto chiuso bene.
- Quando carico metto i campioni su un pezzo di parafilm e su un parafilm A PARTE ci metto il colorante per il negativo
- carico il negativo prima di tutto
- Carico i campioni lasciando uno spazio a parte tra il negativo e i campioni
- Caricament perfetto nn esce NULLA
I negativi sempre e rigorosamente contaminati.
Ora vorrei capire cosa faccio di sbagliato IO. Uno potrebbe dire che e' ovviamente perche' sullo stesos bancone di PCR ci caricano i campioni e ci fanno le precipitazioni ma all'altra ragzza nn vengono mai contaminate. Vorrei capire
grazie a tutti
un saluto
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Gabriele
Utente
Prov.: Pisa
Città: Pisa
615 Messaggi |
Inserito il - 21 ottobre 2011 : 17:16:32
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| con cosa pulisci la postazione e le pipette? |
"Chi rinuncia alla libertà per la sicurezza, non merita né la libertà né la sicurezza. E finirà col perdere entrambe." |
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stella_c84
Nuovo Arrivato
11 Messaggi |
Inserito il - 21 ottobre 2011 : 17:22:52
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| Con etanolo....e' l'unica cosa che hanno li' dentro. Nn hanno altro ne' mi danno altro |
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SpemannOrganizer
Utente
Città: Los Angeles
955 Messaggi |
Inserito il - 21 ottobre 2011 : 18:11:18
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| tu e l'altra ragazza usate stessi reagenti? dNTPs, acqua, primers? usate anche le stesse pipette? |
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roberta.s
Utente Junior
Città: Parigi
564 Messaggi |
Inserito il - 21 ottobre 2011 : 18:18:57
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Perchè non provi a fare un'altra PCR (con primers diversi) e vedi se hai la stessa contaminazione?
Io comunque cambierei tutto: nuovo kit per la PCR, acqua milliq (io la preferisco sempre a quella autoclavata) e nuovi primers. Sinceramente non credo che la contaminazione vanga da pipette ecc. Comunque, per sicurezza, apri un nuovo pacco di tips. |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 21 ottobre 2011 : 18:20:30
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Prima di tutto, se "pulisci" con Etanolo non stai affatto pulendo!
L'etanolo non elimina assolutamente il DNA, anzi al contrario lo fissa, viene appunto utilizzato per estrarre il DNA.
Quindi prima di tutto se vuoi pulire fallo in modo corretto, devi utilizzare la candeggina, nel caso non avessi in laboratorio ipoclorito di sodio puoi benissimo procurarti la candeggina al supermercato. Prepara una diluizione 1:10 di candeggina commerciale e utilizza quella per pulire tutto, per passare le pipette ti consiglio di bagnare un po' di carta con quella soluzione e passare le pipette, dovresti (puoi anche mettere la soluzione in uno spray e usare quello, a me personalmente non piace molto). Comunque dopo aver passato tutto con la soluzione di candeggina lascia agire una decina di minuti e poi risciacqua con acqua. A questo punto hai tutto pulito!
Per il resto quoto SpemannOrganizer: "tu e l'altra ragazza usate stessi reagenti? dNTPs, acqua, primers?"
ad es. se amplificate frammenti diversi, quindi utilizzate primers diversi potrebbe essere che la contaminazione venga dai tuoi primers. |
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stella_c84
Nuovo Arrivato
11 Messaggi |
Inserito il - 21 ottobre 2011 : 18:46:16
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No i reagenti sono tutti nuovi e puliti, come ho spoegato nel mio post abbiamo fatto pcr x confermare. Mi sono scordata di metterlo ma le abbiamo fatte x tutti i vari primers. Percio' quello nn e'. Mi sono messa qui xche' manco loro stessi mi san dare una spiegazione.
Cmq no niente candeggina e se la provo ad usare mi si in%^#|, x cui nn posso proprio. Li' c'e' solo etanolo e basta e gia' quando uso quello mi guardano male xche' secondo loro nn serve pulire. |
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roberta.s
Utente Junior
Città: Parigi
564 Messaggi |
Inserito il - 21 ottobre 2011 : 18:56:55
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| Mah, l'ultima idea che mi viene in mente è: parli mentre prepari la PCR? |
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stella_c84
Nuovo Arrivato
11 Messaggi |
Inserito il - 21 ottobre 2011 : 20:11:27
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Infatti era quello che dicevo, di tornare in topic che x me sarebbe molto utile dato che sono qui x avere suggerimenti o quant'altro ( relativo alla mia domanda, of course).
La posto qui nn so chi rispondera': cmq magari dico una fesseria ma si pottebbero nn so contaminare in macchina? Ripeto, srnza che nessuno se la prenda a male se e' una fesseria (nn sono esperta in biol molevolare) ma una volta mentre ero di visita a dei lab a Roma mi pare di ricordare che un ragazzo che ci ha fatto vedere i lab di biologia molecolare del posto e ci spiego' la PCR ci disse che alcune volte i vapori in macchina possono contaminare il neg. Magari ricordo male nn so pero' mi pare disse cosi'. Tanto piu' che la banda nel neg ha sempre la stessa altezza delle bande dei campioni che separo |
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Martin.diagnostica
Utente Attivo
1582 Messaggi |
Inserito il - 21 ottobre 2011 : 23:45:15
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se fosse la macchina (cosa improbabile) ci sarebbero scene di panico in quel lab con ricercatori che si provocano la morte appoggiando la faccia su di un transilluminatore :D
(è una battuta ovviamente)
Mi sembra di capire che sei un principiante, tutti lo siamo stati non c'è nulla di male consentimi alcuni quesiti:
1. Sei un outsider? nessuno ti affianca mentre lavori? non è che ti voglio sfottere, però sarebbe importante almeno per i primi tempi che qualcuno ti seguisse
2. Visto l'errore grossolano dell'utilizzo di etanolo, che io vedevo giornalmente compiere ad una dott.ssa in medicina ricercatrice che "avrebbe" dovuto istruirmi (quindi non demoralizzarti è abbastanza comune) mi permetto una seconda domanda un pò scontata: usi punte, eppendorf e H2O sterili? Anche H2O va aliquotata e congelata
3. hai per caso litigato col tuo vicino. Potrebbe sputarti nei tubi e rubare i tuoi ab anti-cdx parlo per esperienza personale |
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mikymiky
Nuovo Arrivato
Prov.: Brescia
Città: lonato
45 Messaggi |
Inserito il - 21 ottobre 2011 : 23:51:34
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ma una domanda: per PCR "vuote" cosa intendi innanzitutto?
perchè l'unico controllo di pcr che puoi avere è un negativo, cioè quello che già stai facendo, cioè senza templato!! non capisco per "vuote" che differenza ci sia!!
poi altra domanda: la contaminazione che vedi a che altezza è???
tieni presente che fino a 100bp si potrebbe trattare di prodotti di amplificazione dei primers! (nel caso di appaiamento tra di essi). |
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SpemannOrganizer
Utente
Città: Los Angeles
955 Messaggi |
Inserito il - 22 ottobre 2011 : 00:14:29
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beh, se dici che tutti i reagenti sono a posto mi fido di quello che dici e vedi. Sono portato a pensare che le pipette siano contaminate. Usi puntali filtrati? In caso contrario, la contaminazione delle pipette potrebbe essere + che plausibile. A questo punto prova a fare una PCR con i tuoi reagenti ma con le pipette di qualcun altro.
Infine, cerca di spiegare al tuo capo, o referente o quello che vuoi, che lavorare pulito ed avere i tuoi spazi è una tua NECESSITA'. Non ho mai sentito da nessuna parte che ti guardano male perchè ci tieni a mantenere pulito il tuo ambiente di lavoro e mi spiace che ti accada. Spiega quindi che è importante pulire le tue pipette nelle modalità già suggerite da GFPina (l'EtOH lo puoi usare giusto per levarci le schifezze come il loading buffer ecc).
In bocca al lupo! |
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Gabriele
Utente
Prov.: Pisa
Città: Pisa
615 Messaggi |
Inserito il - 22 ottobre 2011 : 00:50:38
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| Io pulirei tutto con NaOH 0,1 N ma mi pare di capire che non ti è possibile, la candeggina a lungo andare rischia di incrostare l'interno delle pipette, l'etanolo fa poco o nulla. |
"Chi rinuncia alla libertà per la sicurezza, non merita né la libertà né la sicurezza. E finirà col perdere entrambe." |
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stella_c84
Nuovo Arrivato
11 Messaggi |
Inserito il - 22 ottobre 2011 : 03:04:07
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3. hai per caso litigato col tuo vicino. Potrebbe sputarti nei tubi e rubare i tuoi ab anti-cdx parlo per esperienza personale
Ahahahah ma che vicini avevi??? No cmq no non ho litigato con la mia vicina. Anzi lol e' una brava xsona. Non e' che sono una principiante cioe' diciamo che in biol mol non ho lavorato tantissimo. No mi sono fatta affiancare, tanto e' vero che ho chiesto a una ragazza che sta lu' da anni di guardarmi. In pratica la procedura spiegata da me lu' sopra l'ho messa in atto davanti a lei. Lei mi ha vista guardata e seguita in tutte le fasi e ha detto che nn ha visto niente di erroneo in quello che facevo. Anzi. L'ho fatto x togliermi il dubbio.
La scelta dell'etanolo nn era la mia. L'acqua mi hanno detto di no e mi hanno messo in mano l'etanolo. Quando ho chiesto se x caso avevano detergenti specifici hanno riso. Dice che se voglio pulire c'e' solo l'etanolo.
La banda nel negativo e' sempre alla stessa, identica altezza del gene che vado ad amplificare al che nella mia ignoranza mi fa pensare ad una contaminazione col campione. Che nn so da che derivi...x l'amore di Dio, il neg lo faccio sempre prima, nn c'e' nessun controllo positivo, i campioni li metto a neg chiuso e messo da parte. A sto punto ma da dove viene questa contaminazione????
L'acqua e' aliquotata da loro. Nn so come xche' lo fanno loro ma nn e' congelata, sta a T ambiente.
Questo e' che nn capisco. Se so che l'errore era mua allira nn avevo prob a dirlo ( nn starei qui a chiedere consiglio) ma proprio nn capisco. L'acqua reagenti tutto quello che uso io li usa anche l'altra ragazza. Anche le stesse pipette e si puntali col filtro. Ma a lei nn si contaminano. X cui quello nn puo' essere. Errore mio? Uh, sai quante volte ci ho pensato? Pero' quella mi ha seguira, affiancata e guardata dall'inizio alla fine. Ho fatto anche alcuni punti col metodo che usa lei. Risultato? Pure quella PCR e' uscita contaminata! Anzi erano due PCR tutte e due contaminate, mandate insieme. Entrambe la banda del neg era alla stessa altezza dei rispettivi amplificati ( dei campioni). Ad indicare che li' in quei negativi c'era proprio il campione? Ma come ci e' entrato e' quello che nn ho capito. Reagenti ok, guanti cambiati sempre, neg fatto e chiuso prima di mettere i campioni...boh nn lo so. X questo ho pensato alla macchina |
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stella_c84
Nuovo Arrivato
11 Messaggi |
Inserito il - 22 ottobre 2011 : 03:15:33
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Ho notato un'altra risp qui...le PCR vuote x intenderci sn si i neg pero' mandati a parte. Cioe' x ciascun primer mi ha fatto mandare una pcr senza campioni x testare se fossero i reagenti. Praticamente ho mandato una pcr di soli negativi che usci' alla grande.
Dopo aver mandato i neg a questo punto ho chiesto l'affiancanento dell'altra ragazza con cui ho mandato insieme le due pcr con i campioni. Contaminate entrambe!! I reagenti usati erano gli stessi che sn stati mandati nella pcr con i soli negativi, l'acqua uguale, le pipette ed i puntali ed il banco di lavoro lo stesso. La pcr di soli negativi venne bene (neg appunto) quelle due dopo contaminate. Da li' ho pensato alla macchina, ripeto nella mia ignoranza. Xche' la procedura e' stata fatta bene e supervisionata. E quella ragazza e' dell'altro lab dove hanno una stanza solo x le mix e lavora li' da anni. Ho pensato alla macchina xche' tutti i neg da soli son venuti bene (se io sbaglio in qualcosa allora avreu sicuramente contaminato almeno uno di quelli (dato che nelle Pcr normali escono tutte le volte contaminate) quando i neg vengono mandati con i campioni vengono contaminati. Ovviamente le pcr di soli neg ha escluso cobtaminazioni a provette o reagenti o altro. |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 22 ottobre 2011 : 07:13:42
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Ho cancellato tutta una serie di risposte inutili ed offensive. Ogni altra risposta del genere sarà immediatamente cancellata senza preavviso.
Stella, mi dispiace che tu sia stata attaccata in quel modo, me ne scuso a nome di tutto lo staff di MolecularLab.
Ora continuiamo in pace con la discussione. |
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mikymiky
Nuovo Arrivato
Prov.: Brescia
Città: lonato
45 Messaggi |
Inserito il - 22 ottobre 2011 : 11:01:43
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ma stai amplificando cosa? un gene umano?
perchè in questo caso la cosa che piu mi viene da pensare è che ci sia qualcosa di contaminato tra i reagenti, che magari sia avvenuta dopo la prova con solo i negativi.
in questo caso ti direi di fare di nuovo una pcr con solo il negativo, senza campioni, e vedi se ti viene ancora pulita come prima! perchè altrimenti la cosa più ragionevole è cambiare TUTTI i reagenti!
magari la tua amica non ha contaminazione perchè amplifica qualcosa di diverso dal tuo!
cmq ti dico per esperienza, che quando apri un reagente nuovo, è sempre meglio farti aliquote così eviti di contaminare direttamente lo stock, evitando di portarti dietro ogni volta l'errore! :) |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 22 ottobre 2011 : 11:22:14
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| L'altra cosa che puoi fare è guardare cosa fa esattamente l'altra persona quando fa le sue PCR, per vedere se per caso c'è un qualche passaggio che ti sfugge. |
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Daria85
Utente
678 Messaggi |
Inserito il - 22 ottobre 2011 : 11:50:38
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ma tu usi tue aliquote anche di buffer e mgcl2?o sono comuni?
magari sono quelli il problema?
io proverei a fare sl dei bianchi con aliquote nuove e vecchie di mgcl2 e buffer... |
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stella_c84
Nuovo Arrivato
11 Messaggi |
Inserito il - 22 ottobre 2011 : 13:16:21
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Grazie al moderatore.
Tornando al vecchio discorso, si usiamo aliquote x tutto anche per la goTaq (si chiama cosi'). Amplifico geni di Legionella pneomophila. E l'altra ragazza uguale |
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Daria85
Utente
678 Messaggi |
Inserito il - 22 ottobre 2011 : 15:34:33
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io proverei a prepare aliquote nuove di TUTTO...xkè se il problema di contaminazione è avvenuto durante l aliquotazione allora anke cambiando aliquota nn potrai evitarlo!
un'altra cosa:quando fai la PCR i lid dei tubi ti restano chiusi odelle volte li trovi aperti?
xkè se si aprono allorap uò essere che sia così che si contamini il tuo bianco, cioè, nn è la macchina contaminata, ma i tuoi tubi ke si aprono e lasciao evaporare del materiale che contamina il bianco.
nel caso puoi provare a parafilmare i tappi, anche se utilizz delle safelock sarebbe meglio.:) |
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Pcr sempre contaminate
Didattica
