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valestellina
Nuovo Arrivato
9 Messaggi |
 Inserito il - 08 maggio 2012 : 19:35:13
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Buongiorno ragazzi,
ultimamente sto avendo un problema con il sub-clonaggio di un prodotto di PCR. Mi scuso se il messaggio è lungo, ma vi voglio dare più informazioni possibili.
Vi do i dettagli:
il mio inserto di interesse viene prima amplificato (vettore di partenza pGEX) con primer per l'inserzione di siti per EcoRI e XhoI,
purificato e tagliato (e questa reazione è stata verificata, tutto ok) e poi usato per una reazione di ligazione
con il plasmide accettore (pET-Sumo) digerito con gli stessi enzimi (anche qua il vettore viene tagliato perfettamente, come
controllato su gel) e purificato. 5 ul di reazione di ligazione vengono usati per trasformare 50 ul di E. coli.
Viene allestita una reazione di controllo con il solo vettore tagliato (no inserto).
I risultati che ho ottenuto
sono di 2 tipi: nessuna colonia in nessuna piastra (nemmeno il controllo) oppure colonie numerose su tutte le piastre (con
il controllo molto più popolato della reazione con l'inserto).
Il pET è 5.8 kb mentre l'inserto è di 2 kb
Le estremità di taglio sono sticky e non compatibili fra di loro.
Abbiamo testato diverse procedure:
- doppia digestione
- digestioni singole con inattivazione di un enzima e aggiunta dell'altro (sia prima XhoI e poi EcoRI che il contrario)
- digestioni singole in successione senza fare nient'altro (i due enzimi lavorano nello stesso buffer)
- purificazione o meno dei prodotti di PCR, delle digestioni etc. e poi ligazioni
- purificazione su colonnina o estrazione da gel
- rapporti molari 1:1 e 1:3
- aggiunta di BSA per prevenire star activity (soprattutto per XhoI, perchè EcoRI è HiFi)
- ligazioni a diverse temperature (fra i 15°C e RT) e per diversi tempi (dai 30 minuti all'O/N)
Sulle colonie ottenute negli esperimenti non completamente falliti sono stati fatti sia screening con miniprep+digestioni
analitiche sia colony PCR (in alcuni casi sono stati ottenuti amplificati di taglie sugli 1kb e 1.5 kb e la sequenza non è corretta) - queste ultime
se positive davano una sola banda di amplificazione di circa 0.5 kb che corrisponde alla SUMO-tag (abbiamo usato T7 come primers)
Aggiungo che vorremmo evitare la defosforilazione del vettore perchè poi la fosfatasi è resistente a qualsiasi tipo
di inattivazione (che noi possiamo provare nel mio lab).
Aggiungo anche che vorrei tentare una precipitazione dei vari prodotti in NaAcetato+EtOH+glicogeno, ma purtroppo
nel nostro lab non si usa il glicogeno (siamo in 20 e io sarei l'unica a favore). Ci sono alternative?
Sono alla frutta. Qualche suggerimento?
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zerhos
Utente Junior
Prov.: Pisa
Città: Pisa
421 Messaggi |
Inserito il - 12 maggio 2012 : 21:24:30
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Primo consiglio in assoluto, qualsiasi purificazione tu stia facendo per un clonaggio, passa sempre dalla purificazione da banda!
Inoltre, perchè ti fai problemi con la fosfatasi alcalina, questa generalmente lavora nello stesso buffer degli enzimi di restrizione. Di solito io metto una doppia digestione per 2-3 ore a 37 gradi e poi aggiungo la fosfatasi e lascio un'oretta sempre a 37, quindi corro su gel ed eluisco. Non disattivo nulla e defosforilo SEMPRE indipendentemente dalle estremità.
5ul di ligation potrebbero essere parecchi in 50ul,così rischi di intossicare i batteri. Come fai la ligation, quanto metti di inserto e vettore, considera che ai batteri meno DNA arriva e meglio è.
Il fatto che tu abbia ottenuto colonie potrebbe essere spiegabile con una digestione parziale del vettore.
Infine, i bianchi come sono? puliti, sempre? |
"l'unica differenza tra me e un pazzo è che io non sono pazzo!"
Salvador.Dalì
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Problemi con una reazione di ligazione
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