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 Rimozione coda PolyA
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Soshi Fujiwara
Nuovo Arrivato

Soshifujiwara


60 Messaggi

Inserito il - 21 maggio 2012 : 13:07:41  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Soshi Fujiwara Invia a Soshi Fujiwara un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ciao Ragazzi,
dopo tanto tempo torno su questo forum per invocare il vostro aiuto.

Vorrei rimuovere la coda polyA inserita dalla TaQ polimerasi durante la reazione di amplificazione per rendere il frammento blunt end e inserirlo in un vettore TOPO.

Ovviamente mi è già stato suggerito di provare usando una iProof, ma sul manuale di tale TaQ non c'è scritto il protocollo.

Tale rimozione deve essere fatta sapendo che:
1. Non conosco i primers con cui è stato amplificato il frammento
2. Non conosco la sequenza

Voi avete suggerimenti in merito alla rimozione della coda PolyA (sia con che senza iProof)? Magari conoscete qualche altro protocollo?

GRAZIE!!

SpemannOrganizer
Utente

Spemann

Città: Los Angeles


955 Messaggi

Inserito il - 21 maggio 2012 : 16:24:42  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di SpemannOrganizer Invia a SpemannOrganizer un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
la normale taq polimerasi aggiunge una sola A ad ogni estremità 3'. Non è una poly-A.
Qui sotto trovi conferma:
http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/References/protocols/nucleic-acid-amplification-and-expression-profiling/pcr-protocol/cloning-of-taq-polymerase-amplified-pcr-products.html

In sostanza, questo è utile per effettuare un TA cloning. Se però vuoi ottenere un frammento blunt, la strategia + semplice è quella di utilizzare la T4 polimerasi, enzima che viene utilizzato per fill-in o per 3' removal (nel tuo caso dovrai rimuovere i nucleotidi). Ti suggerisco quindi di guardare in lab se hai il suddetto enzima (immagino di sì perchè è di uso comune, forse al suo posto hai la Klenow che però è meno efficiente nel removal) e guarrdare il data sheet per sapere come utilizzarlo.

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