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tapera
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Inserito il - 06 giugno 2012 : 12:29:11  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di tapera Invia a tapera un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Help aiutatemi...
Decidete di caratterizzare un locus microsatellite tetranucleotidico.
Disegnate a vostro piacimento la sequenza da amplificare che contiene il microsatellite e determinare la lunghezza del prodotto di PCR che otterrete da un individuo eterozigote per 6 e 7 ripetizioni.
Grazieee

0barra1
Utente Senior

Monkey's facepalm

Città: Paris, VIIème arrondissement


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Inserito il - 06 giugno 2012 : 12:57:18  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di 0barra1 Invia a 0barra1 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Prova a scrivere come lo risolveresti tu, da li' se ne puo' discutere assieme.
E' certamente più utile per te :)


PS: benvenuto/a

So, forget Jesus. The stars died so that you could be here today.
A Universe From Nothing, Lawrence Krauss

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tapera
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11 Messaggi

Inserito il - 06 giugno 2012 : 13:04:41  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di tapera Invia a tapera un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Grazie :)

di solito i microsatelliti sono formati da ripetizioni -CA-
allora prendo il mio locus -CACA-
e fino a qui è banale... poi per fare la PCR faccio partire prima il primer in modo da caratterizzare il microsatellite, e poi?
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tapera
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11 Messaggi

Inserito il - 06 giugno 2012 : 13:10:59  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di tapera Invia a tapera un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
cioè :

________________CACA_________________
primer
----->
 
                               <-----
________________GTGT_________________

come faccio a determinarne la lunghezza?
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0barra1
Utente Senior

Monkey's facepalm

Città: Paris, VIIème arrondissement


3847 Messaggi

Inserito il - 06 giugno 2012 : 13:55:04  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di 0barra1 Invia a 0barra1 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ri-ciao
Innanzitutto CACA è l'iterazione del dinucleotide CA, dunque nel tuo caso non è appropriato vista la consegna dell'esercizio che richiede invece un tetranucleotide, come esempio CACG.
Per permettere l'amplificazione, i primer devono essere disegnati di modo tale che si appaino con le sequenenze fiancheggianti il tuo microsatellite, non con il microsatellite stesso. La ripetizione della stessa sequenza, infatti, creerebbe problemi di specificità di target ai primer.

Per la caratterizzazione, si tratterà poi di effettuare un'elettroforesi con il tuo prodotto di PCR, di modo da separare il frammento con 6 ripetizioni CACG (che migrerà più rapidamente nel gel) da quello con 7 ripetizioni CACG, che data la lunghezza procederà più lentamente tra le maglie del gel.
Il risultato finale, percio', sarà un gel con due bande all'altezza di [7 ripetizioni x (4 base/ripetizione) + basi della sequenza fiancheggiante] e [6 ripetizioni x (4 base/ripetizione) + basi della sequenza fiancheggiante]

So, forget Jesus. The stars died so that you could be here today.
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tapera
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11 Messaggi

Inserito il - 06 giugno 2012 : 17:02:01  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di tapera Invia a tapera un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Grazie :)
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tapera
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11 Messaggi

Inserito il - 06 giugno 2012 : 19:02:03  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di tapera Invia a tapera un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
un ultima cosa dato che l'esercizio dice di un individuo eterozigote, secondo te, vuol dire che un allele deve essere di 6 e uno di 7 ripetizioni?
Il mio libro però usa negli esempi CACACA e non CAGT.. Boh
scusami ma ho molti dubbi su questo esercizio, sembra banale ma io non lo capisco proprio uffA!
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roberta.s
Utente Junior

yeast

Città: Parigi


564 Messaggi

Inserito il - 06 giugno 2012 : 19:29:05  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di roberta.s Invia a roberta.s un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
a mio parere la teoria è giustissima, e se si tratta solo di un esercizio teorico mi trovo. ma vi potrebbe essere chiesto come pensate di distinguere su gel 2 frammenti che si differenziano solo per 4 nt
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roberta.s
Utente Junior

yeast

Città: Parigi


564 Messaggi

Inserito il - 06 giugno 2012 : 19:37:21  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di roberta.s Invia a roberta.s un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
comunque sì, un eterozigote ha i due alleli identificanti il microsatellite diversi tra loro. nel tuo caso, dunque, avrà sia l'allele costituito da 6 ripetizioni sia quello costituito da 7.
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tapera
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11 Messaggi

Inserito il - 06 giugno 2012 : 19:43:56  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di tapera Invia a tapera un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
per ottenere due bande ben distinte si possono fare più cicli di PCR.
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roberta.s
Utente Junior

yeast

Città: Parigi


564 Messaggi

Inserito il - 06 giugno 2012 : 19:58:55  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di roberta.s Invia a roberta.s un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
ah, ecco, mi sono trovata una referenza da sola :) http://products.invitrogen.com/ivgn/product/16550100

comunque non credo che aumentando il numero di cicli otterresti qualcosa: avresti solo più DNA alla fine della PCR, quindi bande più spesse e ancora meno distinguibili
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GFPina
Moderatore

GFPina

Città: Milano


8408 Messaggi

Inserito il - 06 giugno 2012 : 21:39:49  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Citazione:
Messaggio inserito da roberta.s

a mio parere la teoria è giustissima, e se si tratta solo di un esercizio teorico mi trovo. ma vi potrebbe essere chiesto come pensate di distinguere su gel 2 frammenti che si differenziano solo per 4 nt


Basta utilizzare un gel di poliacrilammide al posto del gel di agarosio!
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roberta.s
Utente Junior

yeast

Città: Parigi


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Inserito il - 07 giugno 2012 : 10:26:30  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di roberta.s Invia a roberta.s un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
grazie GFPina, c'^è sempre da imparare!
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0barra1
Utente Senior

Monkey's facepalm

Città: Paris, VIIème arrondissement


3847 Messaggi

Inserito il - 07 giugno 2012 : 11:46:17  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di 0barra1 Invia a 0barra1 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Se ci rifletti un istante, sono sicuro che si tratta di una nozione che già possedevi:
la "lettura" dei risultati del sequenziamento di Sanger veniva infatti fatta su gel che potessero permettere la discriminazione di sequenze distinte, e distanti, in lunghezza per una sola base.

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roberta.s
Utente Junior

yeast

Città: Parigi


564 Messaggi

Inserito il - 07 giugno 2012 : 13:16:47  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di roberta.s Invia a roberta.s un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Infatti, non so dove ho la testa. Bella figura :S
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