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Tag   ERK1/1    spingosine kinase    estrogen    estrogeno  Aggiungi Tag

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PIM3
Nuovo Arrivato



19 Messaggi

Inserito il - 15 ottobre 2013 : 11:00:50  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di PIM3 Invia a PIM3 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando

Ragazzi!

Sapreste mica come misurare l'attivazione della MAPK ERK1/2 grazie all'intervento della SK(sphingosine kinase)dopo induzione con estrogeno nelle cellule della linea tumorale al seno MCF-7?

Mi spiego meglio,

SITUAZIONE: quando le cellule MCF7 vengono indotte con E2 (estrogeno) la quantità cellulare di ERK1/2 fosforilato, e quindi attivo, aumenta.

IPOTESI: la sfingosine kinase (SK) è convolta in questo percorso metabolico.

METODOLOGIA: determino, utilizzando un western blot, la quantità di ERk1/2 phosforilato prima e dopo induzione con E2 in cellule stabilmente transfettate con : -empty vector - SK (e quindi overexpression di SK) -mutante negativo dominandte (SK G82D)che blocca l'attivita della SK

RISULTATI: vedo che la quantità di ERk1/2 fosforilato è maggiore nella cellule che overesprimo la sk e nulla nelle cellule che esprimono il mutante.

CONTROPROVA: ?????
quale altro esperimento posso utilizzare per verificare l'ipotesi???

AIUTATEMI SONO DISPERATAAAAAA

chick80
Moderatore

DNA

Città: Edinburgh


11491 Messaggi

Inserito il - 15 ottobre 2013 : 16:47:56  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di chick80 Invia a chick80 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Di già dovresti normalizzare rispetto a Erk1/2 totale (fosforilato e no).

L'altro esperimento da fare potrebbe essere un esperimento di rescue in cui transfetti (transientemente) le tue cellule SKG82D con SKwt e vedi il ripristino della fosforilazione.

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PIM3
Nuovo Arrivato



19 Messaggi

Inserito il - 15 ottobre 2013 : 16:59:44  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di PIM3 Invia a PIM3 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Chick80,

Grazie mille per il suggerimento!

Sarah
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