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Alessia.Gron
Nuovo Arrivato
10 Messaggi |
 Inserito il - 06 novembre 2015 : 09:25:01
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Ciao a tutti,premetto che sono una novizia nella tecnica del western blot e dopo averne eseguiti due con successo, ieri dopo la mia terza western quando ho controllato la membrana per vedere se il trasferimento delle proteine fosse avvenuto mi sono ritrovata con solo una banda dello standard che ho usato e con solo due campioni trasferiti sulla membrana anziché 10!!!; inoltre ho notato che il ghiaccio usato era insolitamente integro quando di solito alla fine del blotting é parzialmente sciolto.
Qualcuno saprebbe dirmi cosa puó essere successo? io non so proprio cosa sia andato storto e oggi dovrei riprovare.... 
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 06 novembre 2015 : 10:32:51
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Da come lo descrivi sembra che ci sia stata un'interruzione di corrente nel tuo sistema e quindi il trasferimento sia iniziato, ma poi si sia interrotto e quindi solo parte si è trasferito. Dici che anche il giacchio non si è sciolto, e questo è un altro indice, se il sistema si è arrestato non si è sviluppato miolto calore e quindi il ghiaccio non si è sciolto.
Controlla che l'apparato per il blotting sia montato correttamente e controlla durante il processo che ci sia sempre passaggio di corrente.
Immagino tu utilizzi un sistema di trasferimento wet, non hai specificato però il voltaggio e i tempi, comunque dovresti vedere che si formano delle bollicine (la quantità dipende dal voltaggio), che sono indice del fatto che tutto stia funzionando, controlla anche dall'alimentatore che continui a funzionare e non si blocchi. |
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Alessia.Gron
Nuovo Arrivato
10 Messaggi |
Inserito il - 06 novembre 2015 : 10:59:04
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Grazie mille per l'esauriente risposta!!!
Di solito setto la macchina per la WB a 100V 0,3A (300mA) per 1h.
Come posso vedere se c'é stato un blocco della corrente? Mi spiego meglio: di solito se si verifica un problema a livello di blocco o passaggio di corrente o in alternativa errori nel montaggio dell'apparato, la macchina lo segnala oppure continua ad andare ? Perché ieri quando ho controllato sul display era tutto come al solito ma leggendo la tua risposta ho avuto conferma del sospetto di aver inserito male i cavi nello strumento.
Se dovesse ricapitarmi posso ripetere il trasferimento sulla stessa membrana invece di ricominciare tutto di nuovo?
Grazie mille per tutti questi preziosi e soprattutto chiari consigli!!
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 11 novembre 2015 : 18:23:51
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Citazione:
Come posso vedere se c'é stato un blocco della corrente? Mi spiego meglio: di solito se si verifica un problema a livello di blocco o passaggio di corrente o in alternativa errori nel montaggio dell'apparato, la macchina lo segnala oppure continua ad andare ?
Dipende dalla strumentazione che hai!
Comunque se non vedi le bolle (e a 100V si dovrebbero vedere bene) non è un buon segno.
Citazione:
Se dovesse ricapitarmi posso ripetere il trasferimento sulla stessa membrana invece di ricominciare tutto di nuovo?
Se ti accorgi che il sistema si è fermato e non smonti l'apparato puoi farlo ripartire, se invece hai smontato il sandwich e hai spostato la membrana è meglio di no, perchè se non è riposizionata esattamente allo stesso modo avresti parte delle proteine blottate in una posizione e parte in un'altra. |
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Alessia.Gron
Nuovo Arrivato
10 Messaggi |
Inserito il - 11 novembre 2015 : 18:40:03
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Grazie ancora per questi preziosi consigli, ho fatto altre WB e ho controllato ogni volta che ci fossero le bolle nella mia camera e sono andate tutte a buon fine.
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Problema trasferimento proteine Western Blot
Didattica
