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Crick82
Utente Junior
139 Messaggi |
 Inserito il - 04 maggio 2007 : 22:59:43
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Se parto da una miscela di RNA totali di determinate cellule, posso amplificare esclusivamente il cDNA di un gene d'interesse?
Io finora ho sempre retrotrascritto tutto l'RNA estratto in cDNA, poi da questo cDNA amplificavo con una PCR solo il cDNA di interesse.
E' possibile unire le due cose in un unico esperimento? Che kit si utilizza per farlo?
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 05 maggio 2007 : 04:42:30
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Certo, puoi fare la retrotrascrizione usando primers specifici invece di usare primer random/polydT.
Usa gli stessi reagenti che usi normalmente, cambia solo i primers.
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Crick82
Utente Junior
139 Messaggi |
Inserito il - 05 maggio 2007 : 11:32:16
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Io di PCR purtroppo non ne faccio, ho solo visto farle.
Vedevo che gli altri facevano prima la retrotrascrizione di tutti gli RNA. Poi con una PCR successiva amplificavano il cDNA d'interesse.
In effetti però, ragionandoci un po' le fasi erano queste:
1)RNA, RANDOM PRIMERS ed acqua DEPC
2)Alla mix di prima si aggiunge Buffer, RNasi out, dNTP e trascrittasi inversa.
Quindi il procedimento è lo stesso? Basta solo sostituire ai random primers, dei primers specifici per il gene da amplificare?
Sono gli stessi primers che si utilizzano per una PCR che parte da DNA o cDNA, anche se all'iniziano avranno un annealing con l'RNA e non con il DNA o cDNA?
Quale sito utilizzate per disegnarli?
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 05 maggio 2007 : 21:34:57
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Allora per retrotrascrivere un cDNA specifico puoi agire i due modi: retotrascivere solo il cDNA che ti interessa e in seguito amplificarlo mediante PCR, oppure fare tutto direttamente in una provetta (in genere si chiama “One Step” o “One-Tube” RT-PCR).
- Nel primo caso utilizzi un primer specifico per retrotrascrivere solo l’mRNA del tuo gene (al posto di random primers o Oligo-dT), questo primer è come il “reverse” primer che usi normalmente nella PCR. In questo caso usi il protocollo normale di retrotrascrizione a secondo dell’enzima che utilizzi.
Ottieni un cDNA formato solo dal gene di interesse e da questo fai una PCR normale.
- Oppure puoi fare un RT-PCR tutto nella stessa provetta. In questo caso metti 2 primers che sono il forward e il reverse della PCR e i due enzimi “trascrittasi inversa” e “DNA polimerasi”, poi fai un protocollo in cui in una prima fase si ha la retrotrascrizione (si attacca solo il primer reverse e si forma il cDNA specifico) e una seconda fare in cui avviene la PCR.
Indicativamente hai questi steps:
- Retrotrascrizione: 50°C per 30min (la temperatura e il tempo possono variare a secondo dell’enzima utilizzato)
- Inattivazione della trascrittasi inversa: 95°C per 15min.
- PCR:
Denaturazione 95°C
Annealing circa 60°C (dipende dai primers)
Allungamento 72°C (dipende dall’enzima)
In genere è meglio utilizzare una Polimerasi “Hot Start” in modo che questa non funzioni durante la fase di retrotrascrizione, evitando quindi la formazione di amplificati aspecifici e venga attivata durante l’inattivazione della trascrittasi.
Un altro fattore importante è la formulazione del Buffer: deve andare bene per entrambi gli enzimi, altrimenti la resa può essere inferiore.
Per fare questo sono stati messi a punto vari kit, se cerchi “One-Step”, “One-Tube”, “Single-Step”, “Single-Tube” RT-PCR o qualcosa del genere ne trovi quanti ne vuoi.
Ad es. questi sono i link di due tra le più famose ditte produttrici:
http://www1.qiagen.com/Products/Pcr/QiagenReverseTranscriptases/OneStepRtPcr.aspx?ShowInfo=1
http://www.ambion.com/catalog/ProdGrp.html?fkApp=&fkSubApp=198&fkProdGrp=386
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Crick82
Utente Junior
139 Messaggi |
Inserito il - 06 maggio 2007 : 03:47:35
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Mi sa che avevo un concetto errato di RT-PCR. Credevo infatti che per RT-PCR si intendesse solo il processo che permetteva di ottenere la copia in cDNA degli RNA di partenza.
Poi credevo che si dovesse fare una PCR per amplificare il cDNA di interesse.
In effetti, da ciò che ho capito sbagliavo la definizione del processo che porta alla sintesi del cDNA che infatti definivo erroneamente RT-PCR.
Invece adesso mi sembra di aver capito che una classica RT-PCR prevede 2 passaggi:
1°passaggio: Sintesi dei cDNA
Parto da RNA totali e utilizzo un kit contenente tra le altre cose la trascrittasi inversa, in questo modo sintetizzo i cDNA totali (cioè la copia in DNA di tutte le molecole di RNA di partenza).
2°passaggio: Amplificazione del cDNA di interesse
Effettuo una PCR, cioè parto dai cDNA totali ed utilizzo un kit contenente una DNA polimerasi (es. Taq polimerasi) e primers specifici per lo specifico cDNA da amplificare. In questo modo amplifico il cDNA di interesse.
Datemi delle certezze please!!
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 07 maggio 2007 : 20:24:12
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Si è così!
RT-PCR è un insieme di due tecniche:
RT = RetroTrascrizione da RNA a cDNA
PCR = amplificazione di un cDNA specifico
che poi come già detto puoi fare in 1 o due steps, ma comunque ci vogliono entrambi gli enzimi!
In genere si dice che è stata fatta una "RT-PCR" ad. es. per valutare l'espressione di un certo gene (senza specificare questi due passaggi!)
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Crick82
Utente Junior
139 Messaggi |
Inserito il - 21 maggio 2007 : 21:06:26
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I programmi per disegnare i primer forniscono varie coppie di primer forward e reverse, se io scelgo una di queste coppie e la indico alla società che si occupa della sintesi di primer, mi verranno forniti:
1) Solo il forward primer ed il reverse primer?
2) I due tipi di primer (forward e reverse) con le loro sequenze complementari?
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valia
Moderatore
Prov.: UK
1001 Messaggi |
Inserito il - 21 maggio 2007 : 23:12:43
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Solo il forward e il reverse!
Le loro sequenze complementari non amplificherebbero nulla (se usati nella stessa reazione)! |
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Crick82
Utente Junior
139 Messaggi |
Inserito il - 22 maggio 2007 : 19:16:13
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Quali attività possiede una trascrittasi inversa, oltre a quella di essere una DNA polimerasi RNA dipendente?
In cosa possono differire le varie trascittasi inverse che si utilizzano (Strata Script - SuperScript III RT della invitrogen). L'uso di queste diverse trascrittasi, utilizzando l'apposito protocollo, permette di ottenere le copie degli RNA presenti, ovvero i cDNA, i cDNA che si ottengono sono dei doppi filamenti di DNA? |
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cristiano
Nuovo Arrivato
Prov.: Novara
Città: novara
37 Messaggi |
Inserito il - 24 maggio 2007 : 16:49:58
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Non so se ha altre attività, sostanzialmente fa la polimerasi a partire da RNA, inoltre elimina dalla miscela di reazione gli eterodimeri DNA-RNA, in modo che uno stesso RNA non possa essere retrotrascritto all'infinito...Per quanto riguarda le differenze delle varie RT commerciali l'unica cosa da guardare è l'efficienza, che deve essere il più possibile vicina al 100% (ovvero: parto da 1ug di RNA, devo ottenere circa 1ug di cDNA). Le migliori sono quelle Applied Biosystems, che però sono anche le più care, ma anche Qiagen o Invitrogen o Promega non sono male.
Certo, i cDNA che ottieni sono double-strand, proprio per definizione il DNA è doppio filamento.
CRI |
CRI |
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Crick82
Utente Junior
139 Messaggi |
Inserito il - 20 giugno 2007 : 19:25:28
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| Attività RNasi H negativa cosa si intende? |
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Crick82
Utente Junior
139 Messaggi |
Inserito il - 20 giugno 2007 : 19:40:30
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Se utilizzo come trascrittasi inversa la Superscript III, partendo da un campione di RNA totale ed impiegando dei random primers, alla fine cosa ottengo)?
1) Dei doppi filamenti costituiti da un filamento di cDNA appaiati ad un filamento di RNA?
2) cDNA a doppio filamento?
3)?
Questo enzima è infatti privo di attività RNasi H, quindi dovrei ottenere doppi filamenti costituiti da un filamento di cDNA ed un filamento di RNA?
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 20 giugno 2007 : 20:18:12
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La prima!!!
Hai un ibrido cDNA:RNA!
Puoi utilizzarlo direttamente nella PCR oppure aggiungere una RNasi H che degrada l'RNA e poi utilizzi il cDNA a singolo filamento per la PCR.
In genere si chiama "First-Strand Synthesis" perché il filamento che viene retrotrascritto è uno solo (quello complementare all'RNA) il secondo filamento viene fatto dalla Taq (o altre DNA-Polimerasi)!
(mi sembra che il buffer della SuperscripIII si chiami first-strand buffer.... ma in questo momento non ci metterei la mano sul fuoco, dovrei controllare in labo!)
Citazione:
Messaggio inserito da Crick82
Attività RNasi H negativa cosa si intende?
Penso che tu abbia già capito cosa significa...
aggiungo solo che si utilizzano enzimi senza questa attività per evitare che l'mRNA venga degradato durante la retrotrascrizione in quanto questo potrebbe portare ad una minore resa e una minor produzione di cDNA "full lenght"
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Crick82
Utente Junior
139 Messaggi |
Inserito il - 24 giugno 2007 : 12:41:52
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Grazie GFpina!!
L'unica cosa ora che ancora non mi è chiara, perchè dopo aver utilizzato la Strata Script III, alcuni utilizzano un passaggio con RNasi prima della PCR, mentre altri no?
Quali sono gli inconvenienti che si hanno non utilizzando il passaggio con RNasi? |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 25 giugno 2007 : 00:51:35
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Citazione:
Messaggio inserito da Crick82
Strata Script III
 StrataScript o SuperScript III... comunque è lo stesso somo entrambe RNase H-
Il motivo per cui dopo la retrotrascrizione con questi enzimi si fa un trattamento con RNasi prima della PCR è per aumentare l'efficienza della PCR.
Se è presente ancora l'RNA si potrebbe legare al DNA che si forma durante la PCR e rendere più difficile l'accesso dei primers... poi in realtà non so quanto veramente questo influisca sull'efficienza della PCR, io personalmente non ho mai fatto il trattamento con RNasi dopo la retrotrascrizione. 
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Martasteria
Nuovo Arrivato
4 Messaggi |
Inserito il - 10 aprile 2017 : 21:48:00
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Ciao a tutti, avrei bisogno di una delucidazione perché a parer mio mi sto "impallando" in calcoli inutili.
Ho calcolato allo spettrofotometro la concentrazione del mio RNA estratto ed il risultato è stato 8278,00 ng/ul.
E' abbastanza contaminato ma voglio provare ugualmente ad effettuare una RT PCR per la quale mi viene richiesto di utilizzare 1ng di RNA estratto.
Ora, considerato che il mio campione iniziale è di soli circa 12 ul credo che il calcolo giusto sia:
8278,00 x 12 = 99,336 ng (totali) e successivamente utilizzando la formuletta
99,336 : 12 = 1 ng (che voglio mettere in reazione): X
X= 0,12ul che dovrei prendere dalla mia estrazione per avere 1ng. Corretto?
Il problema, in caso, sorge qui, prendere 0,12ul è alquanto complicato, dovrei avere un campione ancora più concentrato per poter prendere un volume più grande.
Voi cosa mi consigliate? Dove sto sbagliando?
Vi ringrazio, |
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CrackTheBrain
Nuovo Arrivato
6 Messaggi |
 Inserito il - 10 aprile 2017 : 22:51:21
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 Scritto da MolecularLab Mobile
Ciao, non ho capito un passaggio: da spettrofotometro ti risultano 8278 ng? Come è possibile che moltiplicando per 12 ul ti risultino 99,336 ng? |
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Martasteria
Nuovo Arrivato
4 Messaggi |
Inserito il - 11 aprile 2017 : 16:49:15
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Ho premuto la virgola al posto del punto, è 99.336.
Sì, da spettrofotometro mi risultano 8278,00 ng/ul. |
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CrackTheBrain
Nuovo Arrivato
6 Messaggi |
Inserito il - 11 aprile 2017 : 19:22:01
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Scritto da MolecularLab Mobile
Da spettrofotometro ti risulta che ci sono 8278 ng per ogni ul. Se a te serve 1 ng vuol dire che devi risolvere semplicemente la proporzione 8278 ng:1 ul=1ng:x. Poiché il risultato mi sembra un po' inverosimile forse c è un passaggio nella quantificazione del RNA che è errato o mancante. |
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CrackTheBrain
Nuovo Arrivato
6 Messaggi |
Inserito il - 11 aprile 2017 : 22:20:06
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Scritto da MolecularLab Mobile
Se il risultato fosse davvero questo, allora dovresti pensare di diluire il campione così che sia necessario prelevare più ul per avere 1 ng di RNA. |
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Martasteria
Nuovo Arrivato
4 Messaggi |
Inserito il - 13 aprile 2017 : 16:13:09
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Come sospettavamo (anche io lo pensavo) lo spettrofotometro è guasto.
Lo dovrò ricalcolare appena possibile.
Grazie lo stesso. |
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RT-PCR
Didattica
