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Predatorx10
Nuovo Arrivato
Prov.: Brindisi
Città: brindisi
23 Messaggi |
 Inserito il - 19 ottobre 2007 : 12:07:56
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Buon giorno a tutti mi presento prima di porvi la mia domanda. Mi chiamo giuseppe e sono uno studente del corso di laurea in tecniche di laboratorio biomedico.
Sto studiando per l'esame di biologia molecolare e nel capitolo estrazione degli acidi nucleici mi è sorto un dubbio
Fase spiegatemi:
1 liberazione delle cellule dal tessuto: azoto liquido e sbriciolamento cellule
2 lisi cellulare sciogliendo la polvere nella sost tampone LYSIS BUFFER contenete sali, SDS per la rottura della membrana cellulare,EDTA per sequestrar e Magnesio coofattore delle DNA-asi.
3 Aggiunta della PROTEINASI K che favorisce la digestione della mebrana 50°C x 3h
4 Raffreddata a t.a. aggiungo ugual volume di FENOLO/CLOROFORMIO perche scioglie le sostanze IDROFOBICHE.
5 centrifuco e recupero fase acquosa.
ora il mio dubbio è: ovunque mi giri trovo spiegato che la fase 4 serve a denaturare le proteine come mai questa incongruenza?
oppure è gisuto ed il mio prof a cosi speigato per facilitarci l'apprendimento?
Grazie per l'eventuali risposte.
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imy85x
Nuovo Arrivato
Città: napoli
110 Messaggi |
 Inserito il - 19 ottobre 2007 : 13:03:28
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Da quel che ne so io...
Le proteinasi a temp. ambiente lavorano meglio e spezzettano le proteine.
-aggiungi un volume di fenolo equilibrato a PH 8 (per far precipitare le proteine)
-centrifughi ed otterrai 2 fasi:
1)acquosa o idrofilica
2)fenolica o idrofobica
In tal modo le proteine,che sono anfipatiche(reagiscono sia con H2O e sia con il fenolo) si pongono in mezzo alle 2 fasi,mentre il DNA andrà nella fase acquosa,poichè si lega solo con l'H2O.
-ora,attraverso una pipetta pasteur a punta larga,recuperi il tuo DNA e ripeti l'operazione fino a quando non noti più proteine.
-poi aggiungi del cloroformio,che è un solvente che elimina il fenolo.
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Imy
Le persone che meritano fiducia sono quelle che ti stanno accanto anche quando non le ami abbastanza.
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byo_gio
Nuovo Arrivato
Prov.: MI
Città: Milano
66 Messaggi |
Inserito il - 19 ottobre 2007 : 15:10:57
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citazione da Chick80:
"La struttura di una proteina è determinata dalle forze in atto sui suoi vari gruppi. In generale c'è sempre una minima quantità di acqua che fa un po' da "collante" per tenere la proteina nella sua struttura corretta (es. tramite legami idrogeno).
Se metti una proteina in un ambiente non acquoso come il fenolo o l'isotiocianato, avrai una modifica di queste forze perchè andrai ad aggiungere interazioni aromatiche o di Van der Waals fra il fenolo e i gruppi aromatici e neutri della proteina.
Il meccanismo preciso di denaturazione credo cambi da proteina a proteina." |
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Neuroscience
Utente
659 Messaggi |
Inserito il - 24 ottobre 2007 : 00:54:02
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Concordo a pieno con la citazione di chick80
Aggiungo che le cose scritte da imy85 non mi risultano...
La proteinasi K lavora da 50 a 60 °C, sono le altre proteinasi come alcune caspasi che lavorano a temperatura ambiente... il meccanismo è completamente diverso.
Se metti il fenolo a pH 7.4 con l'acqua la separazione di fase ti verrà male e non ti verranno gli esperimenti, poiché come è noto nella chimica e sta scritto anche sulla boccetta del fenolo c'è una solubilità dell'acqua nel fenolo e fenolo nell'acqua, se aggiungi i fosfolipidi di membrana (praticamente sapone) non avrai una separazione di fase, bensì, se ci sono abbastanza cellule e membrane, un gradiente da fenolo ad acqua.
Per la separazione è necessario aggiungere il cloroformio che esalta le proprietà idrofobiche del fenolo e separa nettamente il fenolo (saturato già in acqua) dalla fase acquosa. L'alcol isamilico in genere aumenta ancora di più il grado di purezza dell'acqua.
Il senso dell'esperimento è di avere una fase netta in cui sono sequestrate le cose che non ti vuoi portare dietro, quindi se aggiungi il cloroformio dopo il meccanismo ha poco senso logico, poiché separi solo quello che è completamente idrofobico, non le membrane e le proteine.
La necessità del fenolo sta appunto nell'alterare l'ambiente acquoso e dare, tramite agitazione, una serie di micelle che a contatto con le proteine altera i legami a ponte idrogeno che si trovano all'esterno ed aprono le proteine esponendo il core idrofobico. Una volta che questo è successo le proteine denaturate si mettono con le membrane all'interfaccia tra la fase acquosa e la fase fenolica.
Il fatto che riesca a sciogliere le parti idrofobiche è ovvio che aiuta ulteriormente, ma non è molto importante dato che le cose effettivamente idrofobiche che si possono trovare in una cellula sono i trigliceridi e poche altre cose. Le membrane sono fatte da fosfolipidi, quindi anfotere come le proteine ed altre cose. Di sicuro non si sciolgono in fenolo, ma galleggerebbero in superficie.
Altra correzione è il punto 2 dove c'è un errore, il lysis buffer funziona soprattutto per la presenza dei sali che fanno disidratare le cellule eucariotiche per osmosi, rendendole più suscettibili alla rottura delle membrane per azione meccanica, l'SDS (praticamente un sapone) aiuta questa fase stabilizzando la disorganizzazione del bilayer lipidico in micelle. In alcune soluzioni di lisi infatti l'SDS non è usato, ne ho diverse (es il GTC, il TRizol, soluzioni per l'estrazione di DNA da tessuti).
Un altro errore è che la proteinasi K favorisce la digestione della membrana... digerisce come dice stesso il nome le proteine in modo aspecifico. In particolare digerisce la matrice extracellulare composta essenzialmente da proteine glicosilate e non. Digerendo queste proteine si disperdono le cellule di un tessuto se devi lisarle. Oppure nel tuo caso ha l'inutile compito di digerire le proteine che possono interferire con i tuoi esperimenti prima di toglierle dalla soluzione. Penso che sia più utile tra la fase 1 e 2 rispetto alla sua attuale posizione 3.
Citazione:
Messaggio inserito da byo_gio
citazione da Chick80:
"La struttura di una proteina è determinata dalle forze in atto sui suoi vari gruppi. In generale c'è sempre una minima quantità di acqua che fa un po' da "collante" per tenere la proteina nella sua struttura corretta (es. tramite legami idrogeno).
Se metti una proteina in un ambiente non acquoso come il fenolo o l'isotiocianato, avrai una modifica di queste forze perchè andrai ad aggiungere interazioni aromatiche o di Van der Waals fra il fenolo e i gruppi aromatici e neutri della proteina.
Il meccanismo preciso di denaturazione credo cambi da proteina a proteina."
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Predatorx10
Nuovo Arrivato
Prov.: Brindisi
Città: brindisi
23 Messaggi |
Inserito il - 24 ottobre 2007 : 11:32:18
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vi ringrazio per le risposte datemi, quindi in conclusione ciò che ha detto il mio prof è corretto
- le proteinasi k digerisce la membrana, penso che l'ha inserita come passaggio 3 per sempificare l'apprendimento dei passaggi; quindi è giusto dire favorisce la digestione della membrana.
- la soluzione Fenolo/cloroformio serve a consetire una corretta separazione di tutte le sostanze idrofobiche da quelle idrofiliche con strato di separazione dato dalle sostanze Anfipatiche, in questo caso le proteine!
bene allora posso andare tranquillo all'esame sapendo d'aver prese bene gli appunti! |
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