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dottomarco
Nuovo Arrivato
18 Messaggi |
 Inserito il - 22 novembre 2007 : 07:15:14
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ho googolato un bel pò ma non riesco a capire se la dna ligasi lavora anche su frammeti single strand (cioè se ho una soluzione con tanti frammenti di dna s.s. me li attacca con legami fosfodiestere?) e se lavora anche su dna d.s. ma non a doppia elica..
Mi serve perchè sto pensando a un progetto in cui ho una sequenza di dna (15-20) nucleotidi fissata a un supporto (microarray) e voglio ibridizzargli 1 dopo l' altro tutti i 4 diversi nucleotidi dove c' è il nucleotide complementare. Poi ho bisogno della dna ligasi per attaccare tutti i nucleotidi appena attaccatisi allo stampo e così ottenere la mia sequenza di dna double strand attaccata al supporto... e volendo poter staccare lo strand appena prodotto alzando la temperatura fino alla temperatura di meltin e ripetere il processo ancora ed ancora.
Grazie a tutti in anticipo
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tommasomoro
Utente Junior
358 Messaggi |
Inserito il - 22 novembre 2007 : 09:59:09
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mi sa che la ligasi ti attacca tutto a caso ed hai alto background
prova a gogolare LIGASE CHAIN REACTION
e' qualcosa di simile ma sempre dipendente
da polimerasi e prmer
se ti interessano degli appunti su:
MOLECULAR AMPLIFICATION TECHNIQUES
AND INSTRUMENTATION
guarda questo a prima vista mi sembra ben fatto:
http://www.sasvrc.qld.gov.au/Assets/Documents/2006%20BBS%207075%20Lecture%204(2)%20NA%20Amplification%20Methods.pdf
se volevi farci dei soldi ecco l'ispirazione:
United States Patent 5,830,711
Barany , et al. November 3, 1998
Thermostable ligase mediated DNA amplification system for the detection of genetic diseases
CIAO
T.
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Cangrande
Utente Junior
Prov.: Verona
280 Messaggi |
Inserito il - 22 novembre 2007 : 11:59:12
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La T4 ligasi e la ligasi di E.coli dovrebbero ligare frammenti su DNA a ds.
La T4 liga incisioni sul ss filamento mentre la ligasi di coli incisioni di entrambi i filamenti.
Adesso volevo guardare se ne esistono per il tuo scopo ma non trovo più il sito. |
Magnifico atque victoriosissimo Domino, Domino Kani Grandi de la Scala. |
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tommasomoro
Utente Junior
358 Messaggi |
Inserito il - 22 novembre 2007 : 13:42:39
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mi sa che comunque ti serve una ligasi termostabile non sono sicuro
che la T4 vada bene
T. |
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dottomarco
Nuovo Arrivato
18 Messaggi |
Inserito il - 22 novembre 2007 : 19:29:55
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intanto grazie a tutti x le risposte.
Volevo però capire... una volta che ho ibridizzato i singoli nucleotidi alla sequenza stampo(che è fissata al supporto) è possibile x una qualche ligasi(suggeritemi voi quale) formare i legami fosfodiesterei tra ogni singolo nucleotide appena aggiunto e quello che gli sta a fianco? .. considerate che
A T C G C T quella sotto è la sequenza attaccata al supporto,quelli sopra sono i nucleotidi
I I I I I I complementari che gli si sono attaccati dopo che li ho aggiunti uno alla volta e
T A G C G A dopo ogni passaggio ho fatto un lavaggio. " I " sono legami idrogeno (solo 1 anzichè 2 e 3 giusto per semplificare il disegno)
A-T-C-G-C-T " - " sono i legami fosfodiesterei che vorrei formare con la dna ligasi.
I I I I I I Poi a questo punto vorrei alzare la temperatura e ottenere quindi la mia nuova
T A G C G A sequenza A-T-C-G-C-T in soluzione
Un altra domanda è: nell' attuale metodo di produzione dei primers o comunque di oligonuclotidi(quella in cui si fissa un linker a un supporto solido e poi si fanno n step (n è la lunghezza della sequenza) in cui si aggiunge un nucleotide alla volta e poi si lava fino ad avere la sequenza cresciuta in verticale)come fanno ad attaccare i nucleotidi uno dopo l' altro??usano una dna ligasi??? |
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dottomarco
Nuovo Arrivato
18 Messaggi |
Inserito il - 22 novembre 2007 : 19:32:49
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non ho fatto l' anteprima del post e ora vedo che l' esemplificazione che avevo fatto è venuta scritta male:
considerate che ogni" I " dovrebbe collegare ogni nucleotide a quello che sta sotto: A con T, T con A, C con G ecc.... |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 23 novembre 2007 : 01:13:54
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Ho modificato il tuo messaggio, adesso si vede correttamente.
Per mantenere la formattazione puoi usare il tag code (vedi questa pagina per spiegazioni su come usare i vari tags) |
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tommasomoro
Utente Junior
358 Messaggi |
Inserito il - 23 novembre 2007 : 08:35:39
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The T4 DNA Ligase catalyzes the formation of a phosphodiester bond between juxtaposed 5'-phosphate and 3'-hydroxyl termini in duplex DNA or RNA with blunt or cohesive-end termini. The enzyme repairs single-strand nicks in duplex DNA, RNA or DNA/RNA hybrids but has no activity on single-stranded nucleic acids (1, 2).
The T4 DNA Ligase requires ATP as cofactor.
T.
una serie di nucleotidi ibridati ad un primer immobilizzato
e' come una serie di nick uno dopo l'altro mi sa che non funziona
o no???????????
T. |
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dottomarco
Nuovo Arrivato
18 Messaggi |
Inserito il - 23 novembre 2007 : 21:53:24
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eh.. è proprio quello che vorrei che qualcuno mi dicesse...
Ma sapete nell' attuale tecnica di sintesi di oligonucleotidi, per esempio per creare primer da zero o per creare i nucleotidi su microarray come fanno ad attaccare un nucleotide dopo l' latro??
dato che fanno aggiunte di un nucleotide alla volta in soluzione e poi lo attaccano all' oligo in costruzione, poi lavano e passano al nucleotide seguente, lo attaccano e lavano i dntps in eccesso ecc.... ma come cavolo li attaccano???? |
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tommasomoro
Utente Junior
358 Messaggi |
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malaga
Nuovo Arrivato
15 Messaggi |
Inserito il - 30 novembre 2007 : 00:58:20
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Nella sintesi chimica degli oligonucleotidi si usano gruppi chimici attivatori e protettori(labili):il primo nucleotide viene fissato a una superficie solida di silice con il 3'OH,il 5'OH è protetto da un gruppo acido labile dimetossitritile per evitare che si formino omopolimeri dello stesso nucleotide (si deve legare un solo nucleotide alla volta);viene rimosso il gruppo protettore e aggiunto il secondo nucleotide attivato al 3'OH con un gruppo DIISOPROPILAMMINICO che reagisce con il 5'OH del nucleotide legato al supporto solido,anche il secondo nt aggiunto è protetto al 5';prima di aggiungere il terzo nucleotide si rimuove l'eccesso del secondo e si rimuove il gruppo protettore dal secondo nt legato alla reasina in modo da permettere il legame del terzo...n cicli fino a un max di ottanata nucleotidi aggiunti.
p.s.UN solo nucleotide,secondo me,non riesce a ibridare con il bersaglio in modo stabile. ciao ciao |
malax |
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tommasomoro
Utente Junior
358 Messaggi |
Inserito il - 30 novembre 2007 : 10:54:26
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non mi ricordo quanto sono lunghi gli oligo quando si fanno i probe radioattivi
su templati, mi sembra fossero esameri ramdom, al posto dei nucleotidi potresti usare
questi
oppure ho detto qualcosa di scorretto?
T.
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