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ser
Nuovo Arrivato
97 Messaggi |
 Inserito il - 17 febbraio 2008 : 13:30:50
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Ciao a tutti
In base a che cosa decido la concentrazione del Dna loading buffer (6X - 10X ETC)da preparare?Che differenza c'è fra quello che ad un colorante e quello a 2 coloranti?
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darkene
Utente Junior
291 Messaggi |
Inserito il - 17 febbraio 2008 : 14:27:44
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la quantità dipende dal volume che carichi nel pozzetto: ad esempio se hai un campione di 10 ul metterai 1 ul del 10x (10/10) oppure 1,66 del 6x (10/6).
per quanto riguarda i coloranti, semplicemente quello a due coloranti migra con due bande colorate diverse (una superiore e una inferiore). alcune volte puoi avere che una delle due bande colorate si sovrappone alla banda di dna di interesse, mascherandola nella rivelazione agli UV. in questo caso puoi usare quello ad un colorante per eliminare la copertura della tua banda. |
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morgan79
Utente Junior
Prov.: Bari
143 Messaggi |
Inserito il - 17 febbraio 2008 : 14:30:53
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Puoi usare la concentrazione del loading buffer a te più congeniale purchè la sua concentrazione finale sia 1X, se decidi di caricare su gel 5 ul di prodotto di pcr in un volume finale di 15 ul puoi usare 1.5ul di 10x o 3 ul di 5x, mentre se ti trovi a caricare su gel del DNA liofilizzato come ad esempio quello ottenuto da una estrazione veloce lo puoi sciogliere direttamente in un preparato di loading buffer 1x. La ricetta che ora non ricordo di solito è riferita ad una preparazione 10x e da lì ti prepari le diluizioni che ti servono.
Per quel che riguarda i loading buffer con diversi coloranti, hanno diversi pesi molecolari e ti servono per farti una idea di quanto deve correre il DNA sul tuo gel in base al peso molecolare del tuo campione. Esistono loading buffer con tre coloranti ad esempio che contengono orange G,xilene cianolo e blu di bromofenolo forniti nei kit di purificazione, e se ti leggi le istruzioni ti dicono con esattezza i pesi molecolari riferiti ad una precisa concentrazione di agarosio del tuo gel |
il sapere non è sufficiente, bisogna applicare; il volere non è sufficiente, bisogna fare |
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morgan79
Utente Junior
Prov.: Bari
143 Messaggi |
 Inserito il - 17 febbraio 2008 : 14:32:30
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cavoli, abbiamo risposto nello stesso momento  |
il sapere non è sufficiente, bisogna applicare; il volere non è sufficiente, bisogna fare |
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ser
Nuovo Arrivato
97 Messaggi |
Inserito il - 17 febbraio 2008 : 20:07:58
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| Grazie ma....se voglio utilizzare quello ad un colorante per non mascherare le bande di DNA ,come lo preparo? Ho letto sul sito la composizione del tipo a due coloranti ma non so come devo fare per quello ad uno solo.per quanto riguarda il problema della concentrazione tutto ok. |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 17 febbraio 2008 : 21:45:24
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Il colorante è solo lì per tua convenienza, tecnicamente potresti anche non metterlo. Anche la concentrazione di saccarosio è molto variabile.
Puoi ad es. fare:
- 25 mg blu di bromofenolo
- 4 g di saccarosio
Portare a 10 ml con H2O distillata
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
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Concentrazione DNA loading buffer
Didattica
