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 Non riesco a spiegarmi i risultati di qRT-PCR
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pcr1
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Inserito il - 10 aprile 2008 : 17:11:00  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di pcr1 Invia a pcr1 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Salve!
Io non riesco a spiegarmi i risultati ottenuti con la quantitativa real time PCR.
Ora cerco di spiegarmi: io voglio misurare il livello di espressione relativa di uno specifico mRNA del gene “X” comparando il wild type, con un mutante A, un mutante B e il doppio mutante AB.
Io ottengo questo tipo di risultati: nel mutante A c’è un upregulation dell’espressione del gene X, nel mutante B c’è una più forte upregulation dell’espressione del gene X. Questo indica che la proteina A e la proteina B sono dei repressori della trascrizione del gene X.
Ma qui sorge il problema, con il doppio mutante ottengo sempre un upregulation più grande rispetto al mutante A, ma più bassa rispetto al mutante B, una via di mezzo insomma.
Non riesco a spiegarmi questo, poiché in teoria il doppio mutante dovrebbe causare un upregulation più grande rispetto al mutante A ma anche rispetto al mutante B.
Il problema è che ho testato diversi tipi di geni (non solo il gene X), con mutante A, B e AB, trovando sempre lo stesso problema.
Qualcuno mi potrebbe illuminare.
Vi ringrazio molto.
Saluti.

chick80
Moderatore

DNA

Città: Edinburgh


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Inserito il - 11 aprile 2008 : 00:54:38  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di chick80 Invia a chick80 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Difficile a dirsi non sapendo in che gene sono mutati e che tipo di mutazioni sono...

Se A e B sono mutazioni sullo stesso gene che è, per es., un fattore di trascrizione la cosa può funzionare.
Le mutazioni singole portano ad un cambiamento conformazionale della proteina che la rende meno attiva, soprattutto con B, ma la combinazione delle due mutazioni porta ad una conformazione con attività intermedia.

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pcr1
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Inserito il - 11 aprile 2008 : 11:57:51  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di pcr1 Invia a pcr1 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
A e B sono mutazioni su due geni differenti, entrambi hanno una loss-of-function mutation.
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pcr1
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5 Messaggi

Inserito il - 11 aprile 2008 : 13:09:31  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di pcr1 Invia a pcr1 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Aggiungo anche che il gene A interagisce direttamente con la cromatina e si trova in un complesso responsabile per la repressione trascrizionale. Mentre il gene B è un recettore che si trova sulla membrana cellulare e quindi non è implicato direttamente con la repressione dei geni, ma regola una cascata enzimatica intracellulare.
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pcr1
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5 Messaggi

Inserito il - 11 aprile 2008 : 13:13:06  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di pcr1 Invia a pcr1 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Scusate, mi sono espresso male: naturalmente la proteina codificata dal gene A interagisce con la cromatina, e il prodotto del gene B è un recettore.
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chick80
Moderatore

DNA

Città: Edinburgh


11491 Messaggi

Inserito il - 11 aprile 2008 : 14:12:32  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di chick80 Invia a chick80 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
A e B interagiscono?

Ad es immagina una situazione del genere:
A reprime la trascrizione direttamente
B reprime la trascrizione attivando una cascata che fosforila A e lo fa legare più fortemente al DNA

Muti A e la trascrizione aumenta, perchè la forma mutata ha un'affinità più bassa per il DNA. Si lega ancora abbastanza poichè A viene sempre fosforilato da B, quindi la trascrizione aumenta solo di poco.
Muti B e A non viene più fosforilato, aumenti di molto la trascrizione perchè A non si lega più bene al DNA senza fosforilazione.
Muti A e B. A non è più fosforilato, ma nella sua forma mutata ha ancora un po' di affinità col DNA, quindi hai una situazione intermedia.

Ovviamente sto solo ipotizzando... ci possono essere molte altre spiegazioni. Essendo B un recettore potrebbe ad es. attivare diverse cascate del segnale che magari hanno effetti opposti, ma quando è mutato ne attivi solo una e non un'altra.

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pcr1
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5 Messaggi

Inserito il - 16 aprile 2008 : 10:34:19  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di pcr1 Invia a pcr1 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Grazie per le tue idee chick80

Saluti
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