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roberta.s
Utente Junior

yeast
Città: Parigi


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Inserito il - 27 settembre 2012 : 13:51:06  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di roberta.s Invia a roberta.s un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Dunque, mi chiedevo: utilizziamo tutti (o quasi) dei kit per estrarre plasmidi da batteri. Ebbene la mia domanda è: su cosa si basa tale estrazione? Come si fa ad isolare il DNA plasmidico da quello genomico?
Potrei cercare da sola la risposta, ma é un po' che non scrivo sul forum, quindi ne approfitto per condividere con voi il mio dubbio:)

roberta.s
Utente Junior

yeast

Città: Parigi


564 Messaggi

Inserito il - 27 settembre 2012 : 14:14:07  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di roberta.s Invia a roberta.s un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ok, non ho resistito:)
Ho trovato questo
http://www.ppsk.usm.my/lecturers/mravi/PDF_FIles/Plasmidextraction2002.pdf

In pratica il pH basico dell'SDS denatura il DNA genomico ma non il DNA plasmidico, essendo quest'ultimo chiuso covalentemente in una conformazione circolare.
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SpemannOrganizer
Utente

Spemann

Città: Los Angeles


955 Messaggi

Inserito il - 27 settembre 2012 : 18:37:40  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di SpemannOrganizer Invia a SpemannOrganizer un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
ma anche il DNA genomico del batterio e' circolare...

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SpemannOrganizer
Utente

Spemann

Città: Los Angeles


955 Messaggi

Inserito il - 27 settembre 2012 : 18:43:04  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di SpemannOrganizer Invia a SpemannOrganizer un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
premetto cmq che nn mi sono mai posto il problema, ma direi si tratti piu' di una questione di dimensioni, il DNA plasmidico passa la matrice delle colonnine su cui si basa il kit, il genomico no, e' piu' grande e nn passa, tant'e' vero che se lo frammenti vortexandolo allora hai contaminazione da genomico... magari appena ho tempo ci do un'occhiata :)

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roberta.s
Utente Junior

yeast

Città: Parigi


564 Messaggi

Inserito il - 27 settembre 2012 : 18:54:53  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di roberta.s Invia a roberta.s un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
credo non si tratti di circolarità, quanto di superavvolgimento, che è una caratteristica del DNA plasmidico
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roberta.s
Utente Junior

yeast

Città: Parigi


564 Messaggi

Inserito il - 27 settembre 2012 : 18:58:26  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di roberta.s Invia a roberta.s un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
pero' se trovi qualcosa fammi sapere :)
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SpemannOrganizer
Utente

Spemann

Città: Los Angeles


955 Messaggi

Inserito il - 27 settembre 2012 : 20:36:59  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di SpemannOrganizer Invia a SpemannOrganizer un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
http://bitesizebio.com/articles/plasmid-v-genomic-dna-extractionthe-difference/

Effettivamente e' una questione di denaturazione-rinaturazione e grandezza: DNA genomico e' piu' grande, nn rinatura mentre il plasmidico si, rinatura e rimane legato alla matrice immagino...

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GFPina
Moderatore

GFPina

Città: Milano


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Inserito il - 27 settembre 2012 : 22:35:07  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Citazione:
Messaggio inserito da SpemannOrganizer

Effettivamente e' una questione di denaturazione-rinaturazione e grandezza: DNA genomico e' piu' grande, nn rinatura mentre il plasmidico si, rinatura e rimane legato alla matrice immagino...


No non è che il DNA plasmidico rinatura e si lega alla matrice mentre il genomico no, ma i due tipi di DNA sono separati "prima" di essere caricati sulla colonnina, il genomico non è caricato altrimenti anche questo si legherebbe alla matrice.
Quello scritto nel tuo primo link Roberta mi sembra sbagliato o quanto meno inesatto.

Comunque quello che succede è questo:
- si utilizza una sostanza alcalina che denatura sia il DNA plasmidico che quello genomico
- si mette una soluzione che neutralizza velocemente il pH (questa è la parte più delicata) e in queste condizioni il DNA plasmidico rinatura completamente, mentre il DNA genomico si rinatura solo parzialmente e male. In questa fase è fondamentale agire velocemente e non vortexare per evitare di rompere il DNA genomico i cui frammenti possono rinaturare.
- nella soluzione è presente anche SDS che denatura le proteine e forma dei complessi insolubili, dopo centrfugazione il DNA genomico non rinaturato rimane intrappolato nel pellet contenente le proteine, mentre il DNA plasmico che è completamente rinaturato rimane in soluzione
- a questo punto basta prelevare "solo" il surnatante, facendo attenzione a non prelevare parte del pellet e il gioco è fatto!
Poi si possono utilizzare colonnine su cui caricare il surnatante contenente il DNA plasmidico oppure riprecipitarlo in etanolo, ma comunque il genomico è già stato eliminato.
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roberta.s
Utente Junior

yeast

Città: Parigi


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Inserito il - 28 settembre 2012 : 00:40:12  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di roberta.s Invia a roberta.s un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Bene bene! Grazie per i ragionamenti fatti e le spiegazioni, mi sono tolta una curiosità:)
Quindi in pratica il DNA plasm si rinatura piú velocemente perché di dimensioni minori? Non per la sua conformazione, giusto?
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SpemannOrganizer
Utente

Spemann

Città: Los Angeles


955 Messaggi

Inserito il - 28 settembre 2012 : 00:43:04  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di SpemannOrganizer Invia a SpemannOrganizer un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
ok, capito... io nn centrifugo ma filtro quindi immagino che il genomico rimanga intrappolato nello schifo-sds che rimane nel filtro...

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GFPina
Moderatore

GFPina

Città: Milano


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Inserito il - 28 settembre 2012 : 12:57:27  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Citazione:
Messaggio inserito da roberta.s

Quindi in pratica il DNA plasm si rinatura piú velocemente perché di dimensioni minori? Non per la sua conformazione, giusto?

Beh sì essenzialmente per quello, anche se anche la conformazione gioca un ruolo, ad es. è più facile la rinaturazione di una molecola circolare che non di una lineare (a parità di lunghezza ovviamente!).

Citazione:
Messaggio inserito da SpemannOrganizer

ok, capito... io nn centrifugo ma filtro quindi immagino che il genomico rimanga intrappolato nello schifo-sds che rimane nel filtro...


Ah ok, io pensavo che per filtro intendessi il "filtrino" delle colonnine!
Sì nel tuo caso anziché formarsi il pellet nella provetta lo hai "spappolato" sul filtro.
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roberta.s
Utente Junior

yeast

Città: Parigi


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Inserito il - 28 settembre 2012 : 15:51:58  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di roberta.s Invia a roberta.s un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ok, ma la circolarità nel caso di estrazione di plasmide da batteri non c'entra, essendo il genoma dei batteri circolare, giusto?
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GFPina
Moderatore

GFPina

Città: Milano


8380 Messaggi

Inserito il - 28 settembre 2012 : 16:07:46  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Beh in realtà c'è anche una differenza nella struttura del DNA tra genomico e plasmidico.
Entrambi sono circolari ma il plasmidico è cccDNA (covalently closed circular DNA), è una struttura più compatta, cercavo un link ma non ho ancora trovato niente di bello, se lo trovo lo posto.
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SpemannOrganizer
Utente

Spemann

Città: Los Angeles


955 Messaggi

Inserito il - 28 settembre 2012 : 18:46:44  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di SpemannOrganizer Invia a SpemannOrganizer un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
quante cose si imparano! :)

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Eltelin
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4 Messaggi

Inserito il - 29 settembre 2012 : 17:16:59  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Eltelin Invia a Eltelin un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Allora, ho appena fatto un esame in tal proposito, di seguito ti allego un breve riassunto del protocollo:
1. lisi alcalina, in presenza di SDS e NaOH (soda) x denaturazione di proteine e acidi nucleici;
2. neutralizzazione con HSS (high salt solution) che contiene potassio acetato/acido acetico, in modo che il dna plasmidico si rinatura e si trova in soluzione con RNA, mentre dna cromosomico precipita con le proteine;
3. estrazione con fenolo/cloroformio 1:1+ centrifugazione x allontanare proteine ancora presenti in soluzione in questo modo esse si trovano in una fase in superficie mentre il dna è nel pellet;
4. separazione precipitazione con etanolo 100%;
5. lavaggio con etanolo 70%;
6. risospensione
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Loraia
Nuovo Arrivato



13 Messaggi

Inserito il - 12 agosto 2013 : 11:30:18  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Loraia Invia a Loraia un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
ciao a tutti!
durante il tirocinio per la tesi di triennale avevo usato un metodo che chiamavamo "mini 1,2,3" per purificare il DNA plasmidico dai colonie batteriche....ora,dopo 3 anni mi ritrovo a doverlo usare di nuovo e essendo in un altro stato non posso andare a riguardare i miei lab book...la referenza per quel protocollo e' "Sambrook J, Frieske J.F, Maniatis T. Extraction and purification of plasmid. In: Molecular cloning: a laboratory manual. Second edition, Cold Spring Harbor, Laboratory Press, 1989, Vol.I, section 1.25-1.33" ma non riesco proprio a trovarlo nella rete.....c'e' per caso qlc che me lo puoi inviare?!!?!?1
grazie mille!
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GFPina
Moderatore

GFPina

Città: Milano


8380 Messaggi

Inserito il - 12 agosto 2013 : 11:58:05  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Il libro non si trova "free", sono disponibili solo pochissime pagine su google books (http://books.google.it/books?id=Bosc5JVxNpkC) e non c'è quella che ti serve.

Però esiste questo che è il protocollo adattato: http://cshprotocols.cshlp.org/content/2006/1/pdb.prot4084.full

altrimenti in rete trovi una marea di protocolli!
Sempre ammesso che tu non possa acquistare un kit su colonnine.
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