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 sequenziamento dopo purificazione banda da gel agarosio
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biocandy
Utente Junior

frangipani


370 Messaggi

Inserito il - 06 marzo 2014 : 14:51:50  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di biocandy Invia a biocandy un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ciao a tutti! Sto usando Gel Qiaex II Extraction Kit per purificare prodotti di PCR (300 pb) dal gel di agarosio. L'eluizione finale è in 20 ul di H2O. Io uso 5 ul dell'eluato in una reazione di sequenziamento (BigDye Terminator) e poi purifico il mio prodotto utilizzando una piastra con membrana. La sequenza che ottengo è purtroppo di pessima qualità, con alcuni spike e un sacco di rumore di fondo. Pensate che dovrei cambiare metodo di purificazione? Qualcuno ha esperienza con questo kit Qiaex II? Grazie!!

biocandy
Utente Junior

frangipani



370 Messaggi

Inserito il - 07 marzo 2014 : 10:22:40  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di biocandy Invia a biocandy un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
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domi84
Moderatore

Smile3D

Città: Glasgow


1704 Messaggi

Inserito il - 09 marzo 2014 : 13:28:22  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di domi84 Invia a domi84 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Non uso niente di tutto quello che usi tu, ma...
Citazione:

Io uso 5 ul dell'eluato in una reazione di sequenziamento


5 ul è un volume, una reazione di sequenziamento è una PCR quindi ha bisogno di una determinata quantità di DNA (in ug o meglio ancora in umol/uM). Cerca di capire la tua reazione che quantità di DNA ha bisogno e quanto DNA stai mettendo...

Il mio blog: http://domi84.blogspot.com/
Le foto che ho scattato...
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biocandy
Utente Junior

frangipani



370 Messaggi

Inserito il - 10 marzo 2014 : 17:45:34  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di biocandy Invia a biocandy un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Si, scusate ho dimenticato di scrivere 5 ul concentrati 17.1 ng/ul
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GFPina
Moderatore

GFPina

Città: Milano


8380 Messaggi

Inserito il - 10 marzo 2014 : 18:24:58  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ma dopo la purificazione hai verificato l'integrità dell'amplificato?
Hai controllato cosa dice nella sezione "troubleshooting"?
Hai provato a contattare il servizio tecnico Qiagen? Sono lì apposta!
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valestellina84
Nuovo Arrivato



3 Messaggi

Inserito il - 22 marzo 2014 : 11:18:24  Mostra Profilo Invia a valestellina84 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Di solito nello step finale di wash prima dell'eluizione si utilizza un buffer a base ti etanolo. Ora, spesso, se non si fa attenzione e non si elimina tutto l'etanolo, il DNA ne rimane contaminato e questo ostacola il sequenziamento.
Hai provato a fare uno spettro del tuo DNA per controllare? Di solito si vede una contaminazione se si ha picco a 230 nm.
In ogni caso, se ne hai la possibilità, io ti consiglierei di utilizzare i kit Promega. Per quanto Qiagen faccia ottimi prodotti, in tutto il mio dipartimento siamo d'accordo che per gel extraction e pcr purification sia meglio Promega. Io utilizzo WizardSV Gel Extraction Kit.
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Miki_
Nuovo Arrivato



29 Messaggi

Inserito il - 25 marzo 2014 : 13:00:40  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Miki_ Invia a Miki_ un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
anche secondo me il kit della promega è meglio. hai controllato in ce range di basi funziona il kit qiagen?perchè magari purifica male i prodotti piccoli
secondo me stai usando un po' poco materiale, non riesci a caricare un po' più roba su gel?
occhio anche a quanto tempo tieni il gel sotto gli uv e a quanto agarosio recuperi perchè potrestri tirarti dietro schifezze...fai un gel un po' lasso (0,8-1%) e bassino.

ps. per mia esperienza se aspetti il servizio clienti qiagen puoi anche morire di vecchiaia prima di avere risposte sensate..
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Mauriello
Nuovo Arrivato

mau



2 Messaggi

Inserito il - 27 marzo 2014 : 14:01:30  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Mauriello Invia a Mauriello un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Per sequenziare coi big dyes devi mettere 10 ng di DNA per ogni 100 bp di lunghezza del tuo frammento. Ne stai mettendo quasi il triplo
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