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 doppia immunofluorescenza con anticorpi primari rabbit
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sam88
Nuovo Arrivato



10 Messaggi

Inserito il - 03 dicembre 2014 : 18:01:53  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di sam88 Invia a sam88 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ciao a tutti, io ho un problema che mi sta assillando la testa da un po di tempo e non sono riuscita ancora a venirne a capo.
Avrei bisogno di fare una doppia immunofluorescenza per due anticorpi su una stessa sezione. Il problema è che questi anticorpi sono entrambi dei rabbit, e quindi anche se un antigene è nucleare e l'altro citoplasmatico è molto probabile che il secondario usato per l'anticorpo primario che riconosce l'antigene nucleare riconosca anche il primario che lega l'antigene citoplasmatico.
Ho provato a cercare degli anticorpi diversi che non sono rabbit, ma non ne ho trovati.
Esiste un qualche metodo che possa ovviare a questo problema?
Grazie a tuttiiii!

Sam

AleXo
Moderatore

OrniAle

Prov.: Estero
Città: San Francisco, California


1550 Messaggi

Inserito il - 04 dicembre 2014 : 04:47:53  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di AleXo  Invia a AleXo un messaggio AOL Invia a AleXo un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
puoi marcare uno con biotina e usare streptavidin come secondario e l'altro boh, direttamente con un alexafluor (il segnale sara' molto + basso dell'altro). Oppure digerisci uno per rimouvere l'fc e usi due secondari: un anti rabbut fc e un anti rabbit vh/vl(fab) specifici.

i tuoi primari sono monoclonali o poly? li trovi depositati all'ATCC?

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chick80
Moderatore

DNA

Città: Edinburgh


11491 Messaggi

Inserito il - 04 dicembre 2014 : 10:14:50  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di chick80 Invia a chick80 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Concordo con AleXo. In ogni caso non puoi usare due secondari diversi.

Esempi di protocollo di coniugazione degli anticorpi:

http://www.lamondlab.com/pdf/fluorantibodies.pdf

Oppure puoi farlo direttamente con un kit, ad es:

http://www.abcam.com/kits/antibody-conjugation-kits

https://www.lifetechnologies.com/uk/en/home/life-science/cell-analysis/labeling-chemistry/protein-and-antibody-chemical-labeling/antibody-protein-labeling-kits/monoclonal-antibody-labeling-kits.html

https://www.sigmaaldrich.com/life-science/cell-biology/antibodies/antibody-products.html?TablePage=14574760

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sam88
Nuovo Arrivato



10 Messaggi

Inserito il - 04 dicembre 2014 : 12:45:37  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di sam88 Invia a sam88 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Grazie per le vostre risposte!!
allora i primari sono entrambi dei poly! perdona l'ignoranza AleXo...ma non conosco l'ATCC!!
quindi usando questi kit di coniugazione potrei marcare direttamente i due primari con due fluorofori diversi eliminando l problema dei secondari, è giusto?
Se è così, risolverei il problema!
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AleXo
Moderatore

OrniAle

Prov.: Estero
Città: San Francisco, California


1550 Messaggi

Inserito il - 05 dicembre 2014 : 02:48:20  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di AleXo  Invia a AleXo un messaggio AOL Invia a AleXo un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
corretto, ma senza secondari il segnale sara' + debole.

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sam88
Nuovo Arrivato



10 Messaggi

Inserito il - 08 dicembre 2014 : 14:08:16  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di sam88 Invia a sam88 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
bè anche se il segnale è più debole penso che si possa tentare lo stesso,
vi ringrazio moltissimo per i suggerimenti! vi farò sapere cosa verrà fuori!
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