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 Primers Test e cocentrazione Mg in PCR
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Tag   Concentrazione Mg    PCR  Aggiungi Tag

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Lia79
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9 Messaggi

Inserito il - 15 dicembre 2014 : 10:44:42  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Lia79 Invia a Lia79 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Prover˛ una PCR con diverse temperature di annealing, ma mi domandavo come giocare con le concentrazioni di Mg.

Di solito uso una concentrazione 1.5 mM di Mg. Quali altre concentrazioni potrei provare (considerando anche che devo incrociarle con 3 temperature di annealing)?

Grazie!

midichloria
Nuovo Arrivato



75 Messaggi

Inserito il - 15 dicembre 2014 : 12:36:00  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di midichloria Invia a midichloria un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Io normalmente uso la taq Phusion. Con questa taq la concentrazione di MgCl2 deve essere 0,5-1 mM pi˙ elevata rispetto alla concentrazione dei dNTPs. Per esempio se la concentrazione finale dei dNTPs Ú 200 ÁM, io di solito uso una concentrazione finale di 0.8 mM di MgCl2.
In presenza di EDTA perˇ la concentrazione va aumentata di un po'.
Bisogna fare attenzione a non esagerare altrimenti diminuisce la specificitß dei primers e quindi del tuo prodotto finale.
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GFPina
Moderatore

GFPina

CittÓ: Milano


8380 Messaggi

Inserito il - 16 dicembre 2014 : 20:31:54  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
La Phusion non Ŕ una Taq!

Se utilizzi una Taq la concentrazione di Magnesio ottimale Ŕ tra 1,5-2 mM, ma si pu˛ diminuire fino a 0,5 o aumentare fino a 4.

Se vuoi aumentare la resa devi aumentare la concentrazione di magnesio, mentre se vuoi aumentare la specificitÓ devi diminuirla.

Io comunque non farei troppe prove tutte assieme, inizia a provare una PCR con diverse Ta e la stessa concentrazione di magnesio, poi in base al risultato vedi cosa cambiare.
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