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 calcolare concentrazione proteine Pierce BCA protein assay
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biocandy
Utente Junior

frangipani


370 Messaggi

Inserito il - 16 maggio 2015 : 21:30:33  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di biocandy Invia a biocandy un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ciao a tutti! Ho ottenuto dei lisati totali estratti da cellule e devo fare un WB. Per misurare la concentrazione dei miei lisati ho usato il kit Pierce BCA protein assay ma mi sto perdendo nei calcoli!
Allora...ho fatto la curva di calibrazione con 8 punti pi¨´ il bianco e ho caricato 25 ul di ogni punto della curva nei pozzetti della mia piastra. Ho caricato anche 25 ul di ogni campione ma usando 5 ul di campione pi¨´ 20 di buffer. In ogni pozzetto ho poi aggiunto 200 ul di working buffer e ho quantificato usando un plate reader.
Il software dello strumento traccia la retta di regressione ed estrapola la concentrazione dei miei campioni. Ora...la concentrazione dei campioni che ottengo devo moltiplicarla per 5 perch¨¦ ho fatto una diluzione 1:5 (5ul campione pi¨´ 20 ul buffer). Corretto? Mi sfugge se devo considerare anche la diluizione 1:8 fatta nel working buffer (25 ul di standard o campione pi¨´ 200 ul di working buffer)...

vi fornisco anche i numeri reali perch¨¦ non so se sono riuscita a spiegarmi chiaramente. Questa ¨¨ la mia curva:

Final BSA Concentration (¦Ìg/mL)
2000
1500
1000
750
500
250
125
25
blank

Questa la curva dopo quantificazione (blank corrected)
1884.996
1571.432
1101.781
757.764
535.908
262.987
94.278
-59.146

Questi i miei campioni (blank corrected):

32.793
172.901
1784.952

Qual ¨¨ la concentrazione finale dei miei campioni?
Vi Ringrazio anticipatamente

Geeko
Utente

Ctenophor1.0

Città: Milano


1042 Messaggi

Inserito il - 21 maggio 2015 : 09:51:00  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Geeko Invia a Geeko un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Scritto da MolecularLab Mobile

Metti un attimo da parte la concentrazione dei tuoi campioni e della BSA. Quello che ti dice il saggio è prima di ogni altra cosa quanto materiale proteico hai in ogni pozzetto, cioè quanti microgrammi di proteina ci sono nel volume standard di reazione (225 uL se ho capito bene). Da qui poi ovviamente poi calcolarti la concentrazione del campione originario (sapendo il volume iniziale che hai usato e di quanto è stato diluito).
Quello che fa il programma (o che puoi fare tu) è calcolarsi una bella retta di interpolazione dell'assorbanza del pozzetto in funzione dei MICROGRAMMI di BSA che tu hai usato come standard. Poi ogni tua assorbanza registrata per i tuoi campioni a concentrazione ignota viene associata ad un corrispondente valore in ug in base alla retta appena calcolata. Quindi quello che tiri fuori in prima analisi sono i microgrammi di proteina che hai in ogni tuo campione. A questo punto devi lasciar perdere la curva di BSA (ha già svolto il suo triste compito). Devi invece sapere quanto VOLUME del tuo campione proteico hai effettivente usato nel saggio! A questo punto è abbastanza ovvio che per calcolare la concentrazione devi dividere i ug di proteina che hai trovato col metodo della retta per il volume in uL del campione che hai effettivamente aggiunto al pozzetto.
Ti è più chiaro?


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