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 Diluizione DNA + o - concentrato
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SimonaBiotech
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18 Messaggi

Inserito il - 08 ottobre 2019 : 00:36:33  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di SimonaBiotech Invia a SimonaBiotech un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ciao a tutti, ho una domanda un po' complessa da spiegare tramite una tastiera, ma ci provo =)

Devo fare una un esperimento dove il volume totale della soluzione è 20 ul (di cui 18 ul di MIX e 2 ul sono del DNA). La concentrazione finale del DNA deve essere di 40 ng/ul.
Queste sono le indicazioni FONDAMENTALI

ora...
io ho 3 campioni di DNA di cui:
DNA 1 ha una conc. iniziale di 200ng/ul
DNA 2 ha una conc. iniziale di 1250 ng/ul
DNA 3 ha una conc. inziale di 98 ng/ul

Sono consapevole del fatto che la formula da usare sia Ci*Vi=Cf*Vf
dove mi interessa la Vi=(Cf*Vf)/Ci

Tuttavia, nel secondo e nel 3° caso dovrei fare una diluizione intermedia.. perché le quantità di DNA risulterebbero troppo piccole nel primo caso e troppo grandi nel secondo caso (tenete presente che ho a disposizione una soluzione madre di circa 55ul per ogni campione) quindi creare una soluzione dove "spreco" 10 ul vorrei evitarlo...

Per esempio nel primo caso avrò:
Vi=(40ng/ul * 20ul)/200 ul = 4 ul --> 4 ul DNA(madre) + 16ul H20 = 20ul (totali) da questa soluzione andrò a prelevare 2 ul da aggiungere ai 18 ul di MIX

Nel secondo caso:
Vi=(40ng/ul*20ul)/1250ng/ul=0,64ul --> in questo caso il DNA è troppo poco da prelevare... faccio quindi una diluzione intermedia giusto?

Nel terzo caso dovrei utilizzare 8,2ul di DNA, sarebbe quindi troppo considerando che poi da questa soluzione dovrei prendere SOLO 2 ul

Come posso fare?
Potrei preparare una soluzione concentrata 20ng/ul in un Vf=10ul?
Poi in questo caso quanto DNA prelevo da aggiungere ai 18 di MIX.

Grazie mille e spero di essere stata chiara.

domi84
Moderatore

Smile3D

Città: Glasgow


1701 Messaggi

Inserito il - 09 ottobre 2019 : 20:29:35  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di domi84 Invia a domi84 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
C'è qualcosa che non mi è chiara...

Citazione:

Devo fare una un esperimento dove il volume totale della soluzione è 20 ul (di cui 18 ul di MIX e 2 ul sono del DNA). La concentrazione finale del DNA deve essere di 40 ng/ul.


Se dici "la concentrazione finale del DNA" io capisco che è la concentrazione finale di DNA nei 20 ul (cioè quello compreso i 18 ul di MIX). Quindi in totale ti servono 20ul*40 ng/ul = 800ng in 2 ul, significa che devi usare un DNA concentrato > o = 400 ng/ul.

Ma poi fai l'esempio:
Citazione:

Vi=(40ng/ul * 20ul)/200 ul = 4 ul --> 4 ul DNA(madre) + 16ul H20 = 20ul (totali) da questa soluzione andrò a prelevare 2 ul da aggiungere ai 18 ul di MIX


Eh no..."4 ul DNA(madre) + 16ul H20 = 20ul (totali)" questi 20 totali sono già concentrati 40 ng/ul. Se ne prendi 2 e li aggiungi ai 18 di Mix la concentrazione finale di DNA sarà 4 ng/ul.

Forse intendevi che devi usare 2 ul di DNA concentrato 40 ng/ul?
In questo caso ti conviene sempre partire da 1 ul di DNA (prendendone di meno rischi di fare un errore di pipettata maggiore) e diluirlo con acqua. In questo modo riduci lo spreco al minimo.
Se 1 ul è concentrato 200ng/ul e lo vuoi 40ng/ul -> 200/40 = 5X lo devi diluire 5 volte quindi 1 ul + 4 ul di acqua e hai risolto.

Ma devi essere sicura di cosa hai bisogno...

Il mio blog: http://domi84.blogspot.com/
Le foto che ho scattato...
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SimonaBiotech
Nuovo Arrivato



18 Messaggi

Inserito il - 10 ottobre 2019 : 21:02:23  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di SimonaBiotech Invia a SimonaBiotech un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ciaoooo!! Grazie per la risposta!!

Allora.... NO. Sicuramente mi sono spiegata male.
Ci riprovo.

La mia reazione finale si deve svolgere in un volume totale di 20 ul composti da 18 ul di mix + 2 ul di DNA.

I 2 ul di DNA DEVONO essere concentrati 40 ng/ul.

Il mio dubbio sta nel fatto che in alcuni casi le pipettate sono veramente troppo piccole e rischio l'errore (come giustamente suggerivi tu).

Quindi avevo pensato di fare delle diluizioni "intermedie" a 20 ng/ul e poi pescare da da lì...

Tipo: Vi=(20ng/ul*10ul)/1250ng/ul=0,16ul --> troppo piccoli da pipettare, ma se invece:

Vi= (20 ng/ul*60 ul)/1250 ng/ul = 0,96 ul in 59,04 di H20 --> sarebbero più facili da pipettare...

Da quest'ultima soluzione potrei prendere 2ul e aggiungerli alla 18 di Mix.

Giusto?

Il calcolo che hai fatto tu invece è con il fattore di diluizione giusto?

Se volessi farlo in quel modo dovrei fare:

FD=1250/40 = 31,25 poi come proseguo?

Grazie mille e scusami se mi sono spiegata male.

Simona
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domi84
Moderatore

Smile3D

Città: Glasgow


1701 Messaggi

Inserito il - 11 ottobre 2019 : 00:08:06  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di domi84 Invia a domi84 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Citazione:
FD=1250/40 = 31,25 poi come proseguo?

1 ul di DNA e 30,25 di acqua :)

Il mio blog: http://domi84.blogspot.com/
Le foto che ho scattato...
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SimonaBiotech
Nuovo Arrivato



18 Messaggi

Inserito il - 12 ottobre 2019 : 17:04:09  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di SimonaBiotech Invia a SimonaBiotech un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
ahahahah ok!!

Scusami!!

non mi sento mai sicura sui calcoli ahaha

Quindi il ragionamento ti torna?
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