PureLink™ Total RNA Blood

Descrizione

la tecnica consiste nella purificazione dell'RNA totale da sangue intero necessario per la successiva RT-PCR e PCR. Io la trovo di ottimo livello, per la quantità e qualità di RNA estratto, oltre ai costi contenuti ed ai tempi ristretti.

  • PURIFICAZIONE total RNA con metodo PureLink (INVITROGEN)

  • PureLink™ Total RNA Blood Purification Kit For isolating total RNA from whole blood

  • Catalog no. K1560-01


  • I reagenti inclusi sono sufficenti per realizzare 50 isolamenti

  • Lysis Buffer (L3) 17.5 ml

  • Lysis Buffer (L5) 175,0 ml

  • Wash Buffer (W4) 60,0 ml

  • Wash Buffer (W5) 10,0 ml

  • RNase-free water 5,0 ml

  • Spin Cartridges with Collection Tubes 50

  • Wash Tubes (2.0 ml) 50

  • Elution Tubes (1.7 ml) 50

  • Il Kit di purificazione di RNA totale da sangue intero PureLink è qualificato dal punto di vista funzionale isolando l’ RNA totale da 200 µl di sangue intero umano come descritto in questo manuale e deve fornire i seguenti risultati:

  • OD260/280 fra 1.6-2.2

  • Il Kit di purificazione di RNA totale da sangue intero PureLink permette la purificazione di RNA totale di alta qualità da 50-500 microl da sangue intero fresco di mammifero

  • Arricchimento dei Leucociti

  • 1.In un tubo sterile e RNAsi-free di formato adatto, aggiungere 5 volumi del buffer di lisi (L5) a 1 volume (da 50 a 500 μl) del campione fresco di sangue

  • 2. Incubare per 10 minuti in ghiaccio. Vortexare il tubo brevemente 2-3 volte durante l'incubazione. La soluzione sarà traslucida.

  • 3.Centrifugare il tubo a 4°C per 10 minuti a 400 x g. Rimuovere il surnatante completamente. Non scartare il pellet poiché contiene i leucociti.

  • 4. Risospendere il pellet dei leucociti in 2 volumi del buffer di lysis (L5). Mescolare bene vortexando brevemente.

  • 5.Centrifugare il tubo a 4°C per 5 minuti a 400 g. Rimuovere il surnatante completamente. Non scartare il pellet perché contiene i leucociti. Continuare immediatamente a punto 6.

  • 6.Risospendere il pellet dei leucociti in 350 µl del buffer di lysis (L3). Miscelare bene vortexando brevemente per risospendere il pellet accertandosi dell’ l'assenza di qualsiasi agglomerato di cellule.

  • 7.Aggiungere 350 µl di etanolo al 70% al tubo e mescolare bene vortexando brevemente. Continuare alla procedura di purificazione.

  • Procedura di Purificazione

  • A.Rimuovere dal pacchetto una cartuccia di separazione in un tubo dell’eluato. Trasferire il lisato dei leucociti ottenuti nel punto 7, nella cartuccia di separazione.

  • B.Centrifugare la cartuccia di separazione a 8.000 × g per 1 minuto alla temperatura ambiente.

  • C.Scartare l’eluato e reinserire la cartuccia di separazione nel tubo della separazione.

  • D.Lavare la cartuccia di separazione con 700 µl del buffer di lavaggio (W4). Centrifugare a 8.000 × g per 30” alla temperatura ambiente.

  • E.Effettuare l'operazione facoltativa di digestione con dnasi) se necessario per eliminare DNA genomico continuare a punto F.

  • F.Lavare la cartuccia di separazione con 500 µl del buffer di lavaggio (W4). Se la digestione della dnasi I fosse realizzata, incubi per 5 minuti alla temperatura ambiente. Dopo centrifughi a 8.000 × g per 30 secondi alla temperatura ambiente. Scarti l’eluato.

  • G.Lavare la cartuccia di separazione con 500 µl del buffer di lavaggio (W5) con etanolo. Centrifugare la cartuccia a 8.000 × g per 30” alla temperatura ambiente.

  • H.Ripetere il punto G una nuova volta.

  • I.Scartare l’eluato e disporre la cartuccia di separazione nel tubo e centrifugare a 8.000 x g per 1’ alla temperatura ambiente per rimuovere tutto il buffer di lavaggio residuo (W5).

  • J.Disporre la cartuccia di separazione in un tubo pulito di eluizione da 1.7-ml.

  • K.Elure con 30-100 μl di acqua sterile e RNAsi-free. Aggiungere l'acqua al centro della cartuccia ed incubare alla temperatura ambiente per 1’.

  • L.Centrifugare la cartuccia di separazione a 8.000 × g per 1 minuto alla temperatura ambiente. Il tubo di eluizione contiene il vostro RNA totale purificato. Rimuovere e scartare la cartuccia.

  • M.Stoccare l’ RNA totale a -80°C o usi il RNA totale per l'applicazione downstream voluta.