preparazione di E.Coli competenti

Descrizione

é un metodo rapido ad alta efficienza per ottenere colture di e.coli

PASSAGGIO IMPORTANTE

  • é fondamentale lavorare in sterilità



  • Partitre da E.coli TOP10, BL21, JM109, XL1 blue, DH1, DH5 o MM294


  • Prendere una colonia singola da una piastra precedentemente incubata a 37° per 16-20 ore e trasferire in 2ml di LB broth in un tubo ventilato da 13ml


  • Incubare a 37°C O7N in agitazione (300cycles/min)


  • prelevare 0.5ml della coltura e inocularli in 50ml di Medium A in una beuta da 500ml
    medium A : LB broth addizionato di:
    MgSO4*7H2O 10mM
    glucosio 0.2%
    (il glucosio funge da fonte addizionale di C assieme al Mg++ stimola l'efficienza di trasformazione)



  • Incubare a 37°C in agitazione(300cycles/min)fino alla fase logaritmica media. La concentrazione batterica non deve superare le 10(alla otto) cellule/ml (OD600-0.3/0.4)


  • Trasferire la coltura in un tubo falcon da 50 ml raffreddata in ghiaccio


  • Mettere in ghiaccio per 10min


  • Centrifugare a 1500rpm per 10 min a 4°C


  • Eliminare il surnatante e lasciare il tubo falcon invertito per 1min per rimuovere bene il terreno


  • Risospendere il pellet in 0.5 ml di medium A raffreddato in ghiaccio


  • Se la risospensione avviene a RT l'efficienza di trasformazione diminuisce di 2 ordini di grandezza


  • Aggiungere 2.5ml di storage solution semplice raffreddata in ghiaccio
    Storage solution: LB broth pH 7.0 addizionato di:
    MgSO4*7H2O 12mM
    glicerina 36%
    PEG(MW 7500) 12%


  • Agitare bene senza vortexare e rimettere in ghiaccio