Materiale Biologico

Embrioni murini al 12.5 giorno post coitum

Materiale Chimico

PBS 1x (Phosphate Buffered Saline, Gibco);
Tripsina/EDTA (Sigma-Aldrich);
DNase I (Sigma-Aldrich): 1 mg/ml di polvere in terreno M2;
Siero fetale bovino (E.U.) (Sigma-Aldrich): inattivato al calore (56 °C) per 30 minuti ed utilizzato alla concentrazione del 10%;
Standard Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) (BioWhittaker, Belgium) addizionato con L-Glutamina (1%) e Penicillina/Streptomicina (1%);
Gelatina (Sigma- Aldrich: “gelatin from porcine skin”): per una concentrazione dello 0,7%, 3,5 g di polvere sono sciolti in 500 ml di acqua distillata ad una temperatura di 37°C. La soluzione viene poi autoclavata e mantenuta ad una temperatura di 4°C.
Mitomicina C (Sigma- Aldrich: “Mitomycin C from Streptomyces caespitosus”

Metodo

Per ottenere Fibroblasti Embrionali Murini puri:
privare gli embrioni di topo al dodicesimo giorno, 12.5 day post coitum (d.p.c.), delle teste, delle viscere e degli abbozzi di coda.
Porre gli embrioni, lavati più volte in PBS, in piastre batteriologiche e sminuzzateli con bisturi sterili. Trasferire il tessuto, ridotto in piccoli frammenti, in falcon da 15ml, incubare per cinque minuti in tripsina/EDTA (5ml), ad una temperatura di 37 °C.
Aggiungere la DNase I 125 µl e, utilizzando una siringa dall’ago di 18-20mm, eseguire una disgregazione manuale.
Incubare la sospensione cellulare per ulteriori cinque minuti, al termine aggiungere 500 µl di siero fetale bovino (E.U.), al fine di bloccare l’azione enzimatica della tripsina/EDTA.
Filtrare il disgregato ottenuto mediante filtri 0.4 µl (Millipore, USA) e diluirlo con terreno DMEM addizionato con il 10% di Siero fetale bovino (E.U.), L-Glutamina (1%) e Penicillina/Streptomicina (1%).
Centrifugare per 10 minuti a 1200 rpm, eliminare il sovranatante.
Risospendere il pellet cellulare con terreno DMEM addizionato con il 10% di Siero fetale bovino (E.U.), L-Glutamina (1%) e Penicillina/Streptomicina (1%).
Seminare un milione di cellule per ogni piastra da 75 cm2, precedentemente trattata con gelatina allo 0,7% in acqua sterile per facilitare l’adesione cellulare.
Incubare le piastre a 37°C in atmosfera satura di umidità, e mantenere al 5% di CO2. Raggiunta l’80-90% di confluenza, congelare le cellule .