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sgrencino
Nuovo Arrivato



18 Messaggi

Inserito il - 26 novembre 2010 : 13:47:22  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di sgrencino Invia a sgrencino un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
La miglior conservazione delle proteine è consigliabile su membrana di nitrocellulosa o su gel di poliacrilammide?

Quali sarebbero le condizioni ottimali per la conservazione delle membrane di nitrocellusa blottate?

Per quanto tempo si potrebbero conservare le membrane senza osservare sostanziali variazioni della successiva reazione immunoenzimatica?

Per quanto riguarda la procedura di recupero dell’anticorpo:
vi sarebbe la possibilità di recuperare l’ Ab primario? Se si, che protocollo consigliereste?
Vi sarebbe la possibilità di recuperare anche l’Ab secondario?
Se si, che protocollo consigliereste?

Per circa quante volte sarebbe possibile riutilizzare gli anticorpi e in condizioni si dovrebbero conservare ?
Questi una volta scongelati per quanto tempo sono conservabili gli anticorpi e in che condizioni?

Grazie in anticipo per le risposte

gilthanas
Nuovo Arrivato

0116_da_CIA



100 Messaggi

Inserito il - 27 novembre 2010 : 16:26:07  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di gilthanas Invia a gilthanas un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Allora, ti rispondo punti per punto:

1) Nitrocellulosa
2) per la conservazione delle membrane di nitrocellusa blottate lasciale in scatoline o bustine con PBS, in maniera tale che la soluzione ricopra interamente la membrana..si può conservare così anche per linghi tempi, bisogna però controllare il livello di pBS che tende ad evaporare col tempo
3) qualche mese (5-6), dopo un anno non la userei più...
4) Per recuperare l'Ab primario basta trasferire la diluizione dell'anticorpo in PBST o TBST a seconda che hai incubato con la membranain una falcon e riusarla coaì x il prossimo WB
5) idem x il secondario
6) si possono riutilizzare qualche volta, 2-3, e basta conservare in frigo (4°C)
7) un anticorpo spesso si conserva in frigo e ci sono anche alcuni Ab che non si devono assolutamente congelare, quindi 4°C va benissimo e si possono conservare per decine di anni senza perdere troppa funzionalità...in genre si comprano si mettono in frigo e li si usa finchè non finiscono (la provetta originale intendo, le diluizioni in PBST o TBST, ripeto, al max 2-3 volte)

Questo tutto in base alla mia esperienza annosa...he he he
Spero sia stato esaustivo
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Iside
Utente Attivo

Iside_paradise

Città: Napoli


1375 Messaggi

Inserito il - 29 novembre 2010 : 16:19:05  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Iside  Invia a Iside un messaggio Yahoo! Invia a Iside un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ti rispondo secondo la mia esperienza:

Citazione:
Messaggio inserito da sgrencino

La miglior conservazione delle proteine è consigliabile su membrana di nitrocellulosa o su gel di poliacrilammide?

decisamente su nitrocellulosa o PVDF



Citazione:
Messaggio inserito da sgrencino

Quali sarebbero le condizioni ottimali per la conservazione delle membrane di nitrocellusa blottate?

dopo aver colorato con ponceau, io asciugo la membrana con carta 3mm e poi la lascio secca fino a quando mi serve, conservata in un foglio di plastica trasparente. Ho blottato anche membrane conservate per più di un anno così.

Citazione:
Messaggio inserito da sgrencino

Per quanto tempo si potrebbero conservare le membrane senza osservare sostanziali variazioni della successiva reazione immunoenzimatica?

Mi ripeto, su membrana secca anche anni.

Citazione:
Messaggio inserito da sgrencino

Per quanto riguarda la procedura di recupero dell’anticorpo:
vi sarebbe la possibilità di recuperare l’ Ab primario? Se si, che protocollo consigliereste?
Vi sarebbe la possibilità di recuperare anche l’Ab secondario?
Se si, che protocollo consigliereste?

E' buona procedura recuperare il primario, specie per gli housekeeping e i primari che funzionano bene. semplicementi li metti in falcon dopo averli usati, aggiungendo N3Na allo 0,02%. I secondari lasciali perdere, anche perchè in genere si usano così diluiti che non ne vale la pena. In più, se volessi recuperarli li dovresti sempre conservare con 0,02% di N3Na per evitare che crescano schifezze, però l'N3Na interferisce con il saggio della perossidasi, quindi meglio farseli freschi

Citazione:
Messaggio inserito da sgrencino

Per circa quante volte sarebbe possibile riutilizzare gli anticorpi e in condizioni si dovrebbero conservare ?

finchè funzionano! l'anti GAPDH io lo uso fino a 10 volte senza problemi


Citazione:
Messaggio inserito da sgrencino

Questi una volta scongelati per quanto tempo sono conservabili gli anticorpi e in che condizioni?

quì chiarisci meglio: parli di ab già diluiti o di stock?

...we're just two lost souls swimming in a fishbawl...year after year...
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Daria85
Utente

aplisia



678 Messaggi

Inserito il - 29 novembre 2010 : 19:19:47  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Daria85 Invia a Daria85 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
io l ho fatto proprio oggi!
dopo il blotting su nitrocellulosa ho colorato cn ponceau, poi lavato cn H2O bidistillata e conservata in busta di plastica trasparente cn un po' di acqua a 4°C!

ziaoooooooooooooo
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sgrencino
Nuovo Arrivato



18 Messaggi

Inserito il - 30 novembre 2010 : 09:51:32  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di sgrencino Invia a sgrencino un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Citazione:
Citazione:
Messaggio inserito da sgrencino

Questi una volta scongelati per quanto tempo sono conservabili gli anticorpi e in che condizioni?

quì chiarisci meglio: parli di ab già diluiti o di stock?


Dato che stò usufruendo della tua disponibilità, vorrei sapere tutte e due! comunque la domanda era per Ab diluiti.
ps: grazie mille
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kristanko
Utente Junior

Città: Bologna


123 Messaggi

Inserito il - 30 novembre 2010 : 10:01:28  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di kristanko Invia a kristanko un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
ma secondo voi, un anticorpo diluito se viene conservato a -20, e che quindi si congela, nel riutilizzarlo perde funzionalità? Meglio a 4 gradi?
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Iside
Utente Attivo

Iside_paradise

Città: Napoli


1375 Messaggi

Inserito il - 30 novembre 2010 : 11:18:33  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Iside  Invia a Iside un messaggio Yahoo! Invia a Iside un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Citazione:
Messaggio inserito da sgrencino

Citazione:
Citazione:
Messaggio inserito da sgrencino

Questi una volta scongelati per quanto tempo sono conservabili gli anticorpi e in che condizioni?

quì chiarisci meglio: parli di ab già diluiti o di stock?


Dato che stò usufruendo della tua disponibilità, vorrei sapere tutte e due! comunque la domanda era per Ab diluiti.
ps: grazie mille



Gli ab diluiti li tieni a +4°C in N3Na 0.02%. Io ho usato una anti actina conservata dal 2006 così e ho avuto uno splendido segnale. Per gli stock, segui le istruzioni del datasheet. Per ab da tenere a -20°C la cosa migliore sarebbe aliquotare.

...we're just two lost souls swimming in a fishbawl...year after year...
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