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frala11
Nuovo Arrivato
19 Messaggi |
 Inserito il - 01 giugno 2012 : 10:48:25
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Ciao a tutti!avrei bisogno di una spiegazione sul clonaggio POSIZIONALE perchè si esegue e qual è il protocollo!non trovo spiegazioni nè dai testi nè su internet che più di una definizione non dice molto..help!
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prossima biologa
Utente Attivo
1437 Messaggi |
Inserito il - 01 giugno 2012 : 12:08:25
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cerco di esserti di aiuto:
il clonaggio posizionale si fa per clonare un segmento di DNA genico usando come sonda, un gene la cui posizione è nota e che si sa che è associato al gene che sto cercando.
ti faccio un esempio
quando si cercava di isolare il gene rb, lo studioso weinberg ebbe una intuizione: il gene rb è un oncosoppressore, quindi nelle persone affette da retinoblastoma, il gene manca. weinberg notò una totale corrispondenza in questi soggetti anche dell'assenza del gene dell'elastasi, che si sapeva dove era localizzato sui cromosomi. per cui sapendo che il gene rb si trova sul braccio lungo del cromosoma 13 fare un clonaggio usando sonda centromerica e sonda telomerica, era troppo complicato. se il gene per l'elastasi è associato al gene rb, si usa la sonda per il gene elastasi e clono la regione specifica perchè so che rb lo troverò in posizione vicino al gene che ibriderà con la mia sonda. con il chromosome walking isolo i diversi cloni e successivamente per capire quale clone che ho isolato contine geni e non sequenze di DNA non genico, faccio un saggio trascrizionale. ottengo così solo cloni che mi danno un trascritto primario, e tra questi vedo quali sono espressi nel tessuto di mio interesse, per esempio il retinoblastoma è tumore dell'occhio quindi in soggetti sani cerca tra quelli isolati, quale è espresso nell'occhio, e cerco quindi quelli espressi nel fenotipo normale e che contemporaneamente non sono espressi nel soggetto con tumore, essendo un tumore in questo caso la delezione di rb, so che infatti non lo troverò....
questo è quello che mi hanno spiegato, non so se è quello che volevi sapere..... spero anche solo in piccola parte di esserti stata d'aiuto..... e spero che se qualcuno trova qualcosa che non va, risponda e ci informi così da aiutare anche me!!!
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prossima biologa
Utente Attivo
1437 Messaggi |
Inserito il - 01 giugno 2012 : 12:12:45
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da ciò deduco che si esegue quando non posso fare un clonaggio funzionale perchè il gene quando c'è non ha una funzione, è un oncosoppressore, non ha una proteina... e nel tumore il gene è assente.... quindi come faccio a isolarlo?
faccio questo clonaggio posizionale.
aggiungo una cosa che ho trovato sul quaderno:
lo scopo del clonaggio posizionale è quello di trovare marcatori che fiancheggiano il più possibile il gene in esame. |
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frala11
Nuovo Arrivato
19 Messaggi |
Inserito il - 01 giugno 2012 : 15:42:52
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Ti ringrazio x l'aiuto,sei stata davvero gentile!anche se mi interesserebbe avere un protocollo più generico sul clonaggio posizionale!io ho trovato questi 3 punti:
-usare l'analisi di linkage per mappare il locus della malattia in una regione del cromosoma.
-definire tutti i possibili geni "candidati" nella regione.
-identificare il gene che causa la malattia.
Ma non trovo una spiegazione di queste 3 fasi! |
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Grön
Utente Junior
220 Messaggi |
Inserito il - 02 giugno 2012 : 10:29:21
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Ciao,
ancora non ho affrontato lo studio di questo argomento, ma ci arriverò presto. Comunque, la frase del prof. di ProssimaBiologa mi sembra molto illuminante:
Lo scopo del clonaggio posizionale è quello di trovare marcatori che fiancheggiano il più possibile il gene in esame.
Hai inoltre bisogno di alcuni requisiti per capire l'argomento:
1) Che cos'è il linkage?
2) Che cosa significa "marker" o marcatore? Quali caratteristiche devono avere? Ne conosci di qualche tipo?
Avendo chiari questi, si procede.
Perché devi fare il mappaggio genico con analisi di linkage? Perché ti serve per individuare la posizione (statistica) di un gene, ritenuto responsabile di una malattia. Chiaramente hai bisogno di trovare un riscontro genotipo-fenotipo relativamente lineare per farlo, altrimenti è un problema!
Nella procedura, in pratica:
1) Arruoli famiglie che presentino una determinata malattia genetica. La malattia genetica sarà l'oggetto del tuo studio - e quindi tu vuoi trovare quale sia il gene responsabile della malattia, detto "gene malattia". Quindi, chiami delle famiglie che presentino questa caratteristica.
2) Prelevi dei campioni citologici da queste famiglie, per esempio sfruttando le cellule del sangue (ex. linfociti) che sono facili da prelevare senza troppi problemi.
3) A questo punto devi effettuare un'analisi genotipica. Devi localizzare dei marcatori polimorfici che possano essere in linkage con il (presunto) gene responsabile della malattia che stai studiando. Ci sono dei criteri di base: è auspicabile che il marker e il gene sospettato non siano più distanti di 7.5 cM sulla mappa genica che stai cercando di costruire.
Devi quindi:
- identificare il genotipo relativamente al marker;
- sapendo che c'è un certo tipo di marker sui cromosomi analizzati, devi valutare che relazione c'è tra questo marker che hai trovato.. e il "gene malattia". Puoi cominciare a farlo tenendo d'occhio il fenotipo "malato", che evidentemente ha a che vedere con il "gene malattia".
L'ideale è riuscire a identificare due marcatori, che siano: il primo a monte - il secondo a valle del gene sospettato. In questo modo:
5'-[MarkerMonte]-GeneMalattia-[MarkerValle]-3'
In tal modo "restringi" il campo d'indagine.
Bada che potresti dover restringere più volte il quadro, nel senso che magari tra i due marker che hai scelto potrebbero esserci anche altri geni oltre a quello della malattia, che con la malattia non c'entrano niente.. E quindi dovresti approfondire l'analisi prima di "isolare" il gene che ti interessa.
E prima di porter dire "Ok, ho trovato il gene responsabile della malattia!".
Quindi nel farlo utilizzerai altri "sub-markers" (questo nome me lo son inventato io  ) in modo da aumentare la risoluzione della tua indagine.. fino a limitare il campo a pochi geni, che saranno i cosiddetti "geni candidati".
Bisogna cercare di arrivare a restringere il campo sino a quando la regione "identificata" non corrisponda a 1000 kb.
A questo punto dovranno esser condotte delle analisi computazionali per identificare esoni, siti di splicing, regioni ORF - e fare dei confronti tra tutti i campioni prelevati. (Non so esattamente cosa siano queste analisi computazionali, ti sto riportando le informazioni di cui dispongo io!)
Confrontando i geni candidati tra persone sane e malate (e quindi, confrontando i geni IN PROSPETTIVA della differenza fenotipica che hai negli individui che usi come campione) dovresti riuscire a capire quale sia il gene "differente", responsabile della malattia.
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Dopo che hai trovato (o comunque PENSI di aver trovato) il gene-malattia, devi fare un'analisi che riguardi l'ESPRESSIONE di quel gene.
E per farlo, devi analizzare gli mRNA di quel gene.
Hai vari modi per farlo, il più tipico è il Northern Blot! In pratica, prelevi gli mRNA di una data cellula, li separi con l'aiuto di un'elettroforesi, li "carichi" sulla membrana di nitrocellulosa o quel che è.. e poi, li esponi ad una SONDA (probe) di DNA marcato.
Chiaramente il DNA è stato denaturato e marcato, eh!
Inoltre, avendo già "isolato" e sequenziato il gene, avrai preparato una sonda che sia esattamente in grado di legare (e quindi indirettamente illuminare) l'mRNA che interessa a te, ossia quello derivante dal gene che sospetti sia implicato nella determinazione del fenotipo malato.
In questo modo ottieni i cosiddetti "patterns di espressione genica" - e scopri dove quel gene è espresso, se è epresso molto/poco/nulla..
Il tutto facendo sempre confronti con organismi normali, che non abbiano quel fenotipo malato!
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Volendo, puoi fare ulteriori prove: sequenzi come si deve il gene identificato per vedere QUALI differenze ci sono rispetto ad un gene normale (ex. se c'è stata una mutazione nonsenso o missenso).
Oppure, puoi impiantare quel gene in un organismo-cavia per vedere che effetti sortisce - e quindi avere la conferma che la malattia sia correlata a quel gene. Per farlo, devi iniettare il DNA adeguato in uno dei pronuclei della cellula uovo fecondata. In questo modo otterrai un topolino transgenico che presenterà quel gene mutato a livello costitutivo. Così, vedi come varia il fenotipo del topolino "trattato" rispetto a quello normale.
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Questo è quel che son riuscito a trovare, in qualche modo me lo troverò fatto :D Però se potesse passare qualcuno e darci conferma che è tutto giusto, sarebbe meglio!
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frala11
Nuovo Arrivato
19 Messaggi |
Inserito il - 06 giugno 2012 : 13:04:43
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Grazie!mi sembra + chiaro!!anche se spero nn me lo chieda all'esame  a presto! |
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