| Autore |
Discussione |
|
|
283
Nuovo Arrivato
115 Messaggi |
 Inserito il - 15 giugno 2012 : 14:26:24
|
ciao a tutti.
pongo un'altra discussione.. ho dei campioni di rna estratti con metodo trizol.(me li hanno portati per fare poi pcr)e il rapporto 260/280 è attorno a 1.6. ora,se fosse contaminazione da proteine chiedo a voi :esiste un modo per purificare l'rna ottenuto ? per esempio un clean up con il kit qiagen? non solo ma laconcentrazione di questi campioni è attorno a 4 microgrammi /microlitro.
grazie!
|
|
|
|
|
cami
Utente Junior
Città: roma
136 Messaggi |
Inserito il - 18 giugno 2012 : 11:12:59
|
| Domanda: l'RNA estratto è stato risospeso in acqua? Se fosse così sarebbe normale avere un rapporto 260/280 intorno a 1.6... In ogni caso non è un rapporto così basso, in generale non dovrebbe alterare l'efficienza della retrotrascrizione... |
“Research is what I'm doing when I don't know what I'm doing”Werner von Braun |
 |
|
|
283
Nuovo Arrivato
115 Messaggi |
Inserito il - 18 giugno 2012 : 11:29:03
|
ciao Cami.grazie per aver risposto.
si ho risospeso in H2O. |
|
|
|
0barra1
Utente Senior
Città: Paris, VIIème arrondissement
3847 Messaggi |
Inserito il - 18 giugno 2012 : 11:56:15
|
Non lavoro con RNA, quindi se sbaglio correggetemi, ma credo sia meglio maneggiare troppo l'RNA (per es. facendo purificazioni varie), vista la propensione di questa macromolecola a degradarsi, per non parlare del rischio contaminazione...
|
So, forget Jesus. The stars died so that you could be here today.
A Universe From Nothing, Lawrence Krauss
|
|
|
|
Daria85
Utente
678 Messaggi |
Inserito il - 18 giugno 2012 : 16:27:40
|
io di solito retrotrascrivo 1-2ug, quindi tranquillo che la concentrazione va bene(io a volte ne ho di concentrati 0.9ug\ul).anke il valori di OD sono ok, soprattutto considerando che il trizol non è pulito quanto per es. il kit qiagen.
anke perchè prima di fare la pcr retrotrascriverai a cDNA e quindi al max sarà la concentrazione del cDNA ke valuterai per la pcr :) |
|
|
|
283
Nuovo Arrivato
115 Messaggi |
Inserito il - 18 giugno 2012 : 16:39:31
|
grazie mille per la risp.
ti dico poi cosa ho fatto: ho provato a fare un clean up usando il kit qiagen perchè temevo ci fosse contaminazione.
dopo il clean up la concentrazione è scesa per tre campioni a 4 nanogrammi/microlitro! (ho fatto il clean up solo per un'aliquota)..quindi ora mi sto chiedendo se davvero la concentrazione di prima era alta per presenza di altro.. |
|
|
|
Daria85
Utente
678 Messaggi |
Inserito il - 18 giugno 2012 : 16:55:09
|
può essere...infatti come ti dicevo il trizol è un buon metodo ma meno pulito dei kit!io col kit qiagen allo spettro leggo circa 0,5-1ug di RNA, mai di + (a volte anke 0,1ug...)e una OD intorno a 1.8 .
|
|
|
|
Daria85
Utente
678 Messaggi |
Inserito il - 18 giugno 2012 : 16:57:49
|
| ah , consiglio: prima di leggere allo spettro fai un check su gel all'1%, poi prima di retrotrascrivere digerisci con DNAsi in modo da eliminare eventuale DNA e ricecca su gel. così anke ad occhio puoi capire se la quantificazione allo spettro è giusta o no. |
|
|
|
283
Nuovo Arrivato
115 Messaggi |
Inserito il - 18 giugno 2012 : 16:59:11
|
... cmq proverò lo stesso a fare una real time..giusto per nn buttare via materiale prima di averle provate tutte diciamo.
grazie per le tue risposte |
|
|
|
cami
Utente Junior
Città: roma
136 Messaggi |
Inserito il - 19 giugno 2012 : 11:19:42
|
Concordo in pieno con il consiglio di effettuare una digestione con DNAsi prima della retrotrascrizione, soprattutto dato che poi lavorerai in real time. Per quanto riguarda il discorso della concentrazione, io credo che eventuali contaminanti proteiche non giustifichino una sovrastima della concentrazione di RNA di 1000 volte, tra l'altro con il sistema del Trizol l'RNA in genere è più sporco, ma la resa è anche molto alta... credo sia più probabile che il materiale si sia perso durante la fase di purificazione...
Comunque un'altra cosa che potresti valutare è il rapporto 260/230, che può essere molto basso quando c'è contaminazione da fenoli (e quindi nel caso dell'estrazione col trizol). Se questo rapporto è decente (diciamo superiore a 1.5, invece che 2, date le problematiche della metodica) non dovrebbero esserci problemi per la RT...
 |
“Research is what I'm doing when I don't know what I'm doing”Werner von Braun |
|
|
| |
Discussione |
|
rna estrazione
Didattica
