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laboratorista
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Inserito il - 04 febbraio 2013 : 12:26:58
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Salve ragazzi la domanda che voglio porvi riguarda come si attaccano i primers alle sonde MPLA.La tecnica l'ho compresa bene solo che non riesco a capire come si possa ibridizzare una coppia di primers alle sonde.Bisogna far avvenire una denaturazione della coppia sonda-stampo?I primers si legano testa-coda alle sonde?Non dovrebbero legarsi un primer alla sonda e uno al filamento di DNA Stampo?ci sono molti articoli e post sul forum che ho letto pero' non riesco a capire come si ibridizzano i primers.Grazie a tutti.
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GFPina
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GFPina
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laboratorista
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Inserito il - 04 febbraio 2013 : 13:09:28
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Ciao GFPina ti ringrazio per la velocità nel rispondere,ma allora le sonde short e long si legano su entrambi i filamenti del DNA?Cioè sia al filamento 5'-3' che sul filamento 3'-5'?Quindi se considerassimo di voler amplificare un singolo esone di un gene vi si legherebbero una sonda short e long su un filamento e una sonda short e long sull'altro filamento per un totale di 4 sonde,poi un una coppia di primers forward e reverse che si legano uno al sonda short e uno alla long dei due filamenti?Grazie mille |
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GFPina
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Inserito il - 04 febbraio 2013 : 13:34:58
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Perchè la stai facendo così complicata? La sonda (come tutte le sonde) si lega ad un solo filamento di DNA, l'unica differenza è che è una sonda fatta da due parti, SOLO quando le due parti sono ibridate alla sequenza di DNA sono vicine e la LIGASI le può unire. Ottieni così una sonda intera che può essere amplificata utilizzando i due primers. La sonda è a singolo filamento e credo di aver capito che è questo che ti crea problemi, ma non è affatto un probleme per la PCR, nel primo ciclo si appaia solo uno dei due primers e fa il filamento complementare, poi da quel punto in poi hai entrambi i filamenti che possono essere amplificati. (guarda che è esattamente la stessa cosa che succede nella RT-PCR, dopo la retrotrascrizione il cDNA è a singolo filamento ed è la Taq durante il primo ciclo di PCR a fare il filamento complementare) |
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laboratorista
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Inserito il - 04 febbraio 2013 : 13:49:35
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Grazie mille GFPina ora è tutto chiaro,allora i primers si appaiano in successione?Quindi prima un primer che permette l'estensione del filamento generato da esso,e poi una volta ottenuto quel filamento, in seguito alla denaturazione si lega l'altro primer per sintetizzare l'altro filamento.Proprio come nella RT-PCR,ti ringrazio tantissimo GFPina sei stata risolutiva al 100%,buona giornata. |
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