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kakybiotech
Nuovo Arrivato
Prov.: Macerata
Città: Camerino
21 Messaggi |
 Inserito il - 16 febbraio 2008 : 17:34:35
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Ciao a tutti,
ho un piccolo problemino, che spero di risolvere con l'aiuto di qualcuno che ha più esperienza di me...
Lavoro da circa un anno con una linea cellulare stabilmente transfettata che cresce in DMEM/F12 + G418 per la selezione.
Ieri come al solito ho preparato il medium, ma ho dimenticato di aggiungere il G418, e ho proceduto con il mantenimento cellulare.
solo oggi ho realizzato l'errore commesso ed ho provveduto ad aggiungere l'antibiotico e a sostituire il medium alle cellule.
Domanda: voi ritenete che attraverso questo errore posso avere compromesso in qualche modo la mia linea cellulare stabilmente transfettata???
PS l'episodio di aver dimenticato di aggiungere il G418 è successo solo una volta e lecellule sono state in assenza di antibiotico per meno di 24 ore...
Aspetto fiduciosa vostre risposte
Grazie a tutti  
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Luca-DNA
Nuovo Arrivato
Prov.: Torino
Città: Torino
68 Messaggi |
Inserito il - 16 febbraio 2008 : 18:00:58
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secondo me non corri nessun rischio visto che la linea è rimasta senza antibiotico solo per 24 ore...ed anche in caso estremo di controselezione di qualche cellula, dopo l'aggiunta di G418 hai continuato la selezione di quelle trasfettate, causando la morte delle possibili controselezionate...
Comunque sia e per quanto ne sappia io, meno di 24 ore sono poche per ottenere una controselezione completa delle cellule...vai tranquilla!!! |
A scientific man ought to have no wishes, no affections, - a mere heart of stone. (C. Darwin) |
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Dionysos
Moderatore
Città: Heidelberg
1913 Messaggi |
Inserito il - 16 febbraio 2008 : 19:24:19
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Credo anch'io che ci voglia una certa dose di sfiguz per andare
incontro alla perdita dell'espressione: al limite non utilizzare
subito le cellule per saggi vari, e lasciale un periodo in G418
(normale, oppure leggermente aumentato per fare eventuale piazza
pulita di controselezionati). |
Volere libera : questa é la vera dottrina della volontà e della libertà
(F.W. Nietzsche)
Less Jim Morrison, more Sean Morrison!
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kakybiotech
Nuovo Arrivato
Prov.: Macerata
Città: Camerino
21 Messaggi |
Inserito il - 16 febbraio 2008 : 19:35:03
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Grazie Ragazzi,
allora secondo te Dionysos, se le lascio in G418 fino a giovedì può andare bene? Ti chiedo questo perchè per Giovedì avevo programmato la preparazione di membrane...!!
Grazie ancora...
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Dionysos
Moderatore
Città: Heidelberg
1913 Messaggi |
Inserito il - 16 febbraio 2008 : 19:58:25
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Massì, con un po' di cul non dovresti avere abbassamenti nell'espressione.
Fai comunque una verifica e confrontala con i dati precedenti l'incidente.
Certo cose meglio saperle... |
Volere libera : questa é la vera dottrina della volontà e della libertà
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 17 febbraio 2008 : 00:50:26
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Concordo anche io con Dyonisos. La cosa migliore da fare sarebbe avere un controllo positivo. Ora, non so bene che esperimenti tu stia facendo, ma se hai un qualche test che ti possa chiarire esattamente se tutto va bene (un'immunoistochimica magari?) vai ancora più sul sicuro.
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kakybiotech
Nuovo Arrivato
Prov.: Macerata
Città: Camerino
21 Messaggi |
Inserito il - 17 febbraio 2008 : 14:21:51
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Ciaooo a tutti,
Stamattina, sono andata in lab e ho controllato la crescita cellulare, mi sembra tutto a posto, le cellule sono cresciute bene, non erano staccate o morte... quindi penso di non avere avuto una rilevante controselezione (almeno spero ????), cmq le mantengo in presenza di G418 altri quanttro giorni...!!!
Purtrooppo non posso fare un conrollo, tipo immunoistochimica, perchè non ho un anticorpo specifico.
Qualcuno può consigliarmi un modo alternativo???
Grazie a tutti |
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Dionysos
Moderatore
Città: Heidelberg
1913 Messaggi |
Inserito il - 17 febbraio 2008 : 14:38:02
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Non capisco.
Controselezione significa proliferazione avvantaggiata di cellule che NON posseggono
i marcatori di selezione (= i tuoi vettori di transfezione integrati, che portano la
resistenza all'antibiotico). Il fatto che le cellule siano 'cresciute bene' non c'entra
con la controselezione...anzi, in mancanza di antibiotico è ovvio che le cellule stanno
sempre in ogni caso meglio, ma non è questo il punto: il punto è che potrebbero aver
perso l'omogeneità di espressione che è caratteristica (per definizione) di un clone cellulare.
L'unico modo per valutare la controselezione è testare l'espressione e vedere
se è rimasta uguale a prima (-->bene) oppure se è calata per arricchimento di
una componente cellulare non esprimente (-->male!).
Se non hai l'anticorpo, avrai sicuramente qualche altro strumento/metodo per saggiare
l'espressione del gene transfettato: altrimenti non sarebbe stato possibile
isolare una linea cellula stabilmente esprimente, no??
Informati su come la linea è stata ottenuta. |
Volere libera : questa é la vera dottrina della volontà e della libertà
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kakybiotech
Nuovo Arrivato
Prov.: Macerata
Città: Camerino
21 Messaggi |
 Inserito il - 17 febbraio 2008 : 20:56:37
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Io non capisco...
allora, solo le cellule stabilmente transfettate sono in grado di crescere in presenza di G418, questo perchè possiedono insieme al gene di mio interesse anche quello che conferisce la resistenza....
Le mie cellule selezionate da più di un anno, sono state in assenza di antibiotico solo per meno di 24 ore, successivamente ho provveduto a rimpiazzare il medium privo di G418 con quello contenente l'antibiotico suddetto, quindi il fatto che oggi (in presenza di antibiotico), le cellule sono cresciute dovrebbe teoricamente confortarmi... questo perchè se in quelle circa 20 ore mi si erano selezionate cellule che non posseggono il mio marcatore di selezione, in queste ore e nei prossimi giorni dovrebbero non crescere giusto??? |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
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cellule stabilmente transfettate in pericolo
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