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 IMMUNOFLUORESCENZA (PFA/TRITON)
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Oriantro
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2 Messaggi

Inserito il - 17 agosto 2019 : 15:42:16  Mostra Profilo Invia a Oriantro un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Buonasera a tutti.
Scrivo per chiedere delucidazioni in merito ad alcuni punti di un protocollo specifico di Immunoflurescenza usando PFA e TRITON.
Sono in procinto di conseguire la laurea triennale in scienze biologiche e per questo,ho cominciato a svolgere il tirocinio per la stesura della tesi. Mi preme fare una premessa:purtroppo il mio corso di laurea è stato a dir poco deludente in termini di esperienza di laboratorio,per tale motivo chiedo scusa in anticipo per le domande banali che vi saranno poste.
1) In questo protocollo deve essere effettuata una permeabilizzazione con PBS+TRITON: concentrazione da 0,1% a 0,3% in funzione dell'anticorpo usato (per una multiwell da 6 pozzetti aggiungo 1mL di soluzione;per una multiwell da 24 aggiungo 0,5 mL di soluzione).
Io non ho capito come prepararmi la soluzione! Non dovrei avere un volume iniziale di riferimento per calcolarmi lo 0,1% oppure lo 0,3%? Mi potreste spiegare bene quali calcoli bisogna effettuare?

2) Incubazione con anticorpo secondario diluito (diluizione 1:100 o 1:200) in PBS/BSA/siero.

Significa che devo aggiungere un microlitro di anticorpo in 100 microlitri o 200 microlitri di PBS/BSA/siero?


Vi ringrazio molto,ma ho trascorso i miei primi cinque giorni per la prima volta in un laboratorio di ricerca e mi sono sentita molto scoraggiata in quanto non credevo di incontrare diverse difficoltà e tra queste,anche lo svolgere calcoli simili.
Grazie a tutti per la risposta.

sofychan
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35 Messaggi

Inserito il - 19 agosto 2019 : 08:00:54  Mostra Profilo Invia a sofychan un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
1) Si' il Triton-X lo preprari a una concentrazione 0.1-0.5% v/v in un volume finale noto. Ad esempio su lo 0.3% è semplicemente 0.3 mL Triton-X in un volume di 100 mL PBS. Piu' comodo ovviamente preparare un volume piu' grande di quello calcolato che ti servirebbe.
2) Si' 1:100 = 1 uL in 100 uL etc
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Oriantro
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2 Messaggi

Inserito il - 19 agosto 2019 : 18:47:35  Mostra Profilo Invia a Oriantro un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Grazie mille sofychan!
Quindi se mi viene chiesto di preparare una soluzione con un v=20mL,posso applicare la proporzione Ci:Vi=Cf:Vf? Es: 0,3:100=X:20--> effettuando i calcoli dovrei usare 0,06mL di Triton o meglio 60uL,ma è qui che mi blocco! Prima aggiungo i 60uL di triton e poi porto a volume con il PBS per ottenere 20mL di soluzione?
Inoltre,durante l'esperimento è stato calcolato anche il fattore di diluizione,perchè? Non bastavano quei calcoli?
Grazie mille.
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