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Cosmidi e Fasmidi
 

COSMIDI.
I cosmidi sono DNA circolare ds (come il plasmide pBR322) a cui sono stati aggiunti i siti cos.
Per cui io posso, mantenerlo come plasmide in E.coli, clonare su una resistenza (pBR322 ha la resistenza per Ampicillina e Tetraciclina), e formare grazie a cos i concatameri:
- taglio con Eco dentro una resistenza (per vedere se ho inserito davvero -e in quale colonia- il frammento),
- linearizzo ed aggiungo l'inserto con estremità Eco (cos sono all'interno),
- aggiungo la ligasi
Alla fine ottenendo un DNA ds lineare concatamero che assomiglia a quello di lambda, siccome sto lavorando in vitro, aggiungo code e teste e terminasi e, grazie a cos ho la produzione di particelle fagiche con DNA lineare ds con estremità cos.
In questo modo possono essere utilizzate per infettare E.coli e il DNA lineare ds una volta entrato circolarizza e si replica come un plasmide.
A differenza di lambda non devo indurre la lisi, il plasmide originario anche pi piccolo, quindi posso avere pi spazio per il mio inserto (rispettando comunque la lunghezza totale di 52 Kb per l'impaccamento del DNA fagico costruito).
Con i closmidi posso clonare frammenti fino a 40 Kb.

FASMIDI. (fagemidi)

Parte dal DNA fagico di lambda ma modificato. Infatti al posto dei geni per la lisogenia ci sono pezzi di pBR, ed i soliti componenti tipici (ORI, resistenza, linker).
I tanti pezzettini di pBR servono per raggiungere il TOL (lunghezza totale) di 38 Kb. Questo molecola di DNA ha tutte le caratteriastiche di quelle originarie del fago, e quindi pu dare origine alla via fagica.
Per avere il fasmide con il frammento da clonare:
- taglio,
- aggiungo il mio inserto, grazie a cos, si formano i concatameri.
- impacco in vitro con teste vuote, code e terminasi.
Ottengo così particellefagiche con cui infetto E.coli. Ora, o ho la replicazione come plasmidi od ho la produzione di fagi.
La scelta se effettuare ciclo litico o meno (replicazione dei fasmidi) la decido io, perchè nel genoma iniziale c'era il repressore di lambda (come in tutti i fagi temperati) temperatura sensibile: sotto ad una certa temperatura il repressore è attivo, inibendo la espressione dei geni per la lisi.
Aumentando la temperatura, invece, inattivo il repressore, i geni per la lisi, si attivano e ho la produzione di particelle fagiche.
Questo sistema non offre vantaggi sulle dimensioni, ma permette di avere, a scelta la via plasmidica fagica. Con la via plasmidica avrò una minore produzione di particelle clonate, rispetto a quelle prodotte attraverso l'espressione fagica, ma posso conservarle meglio (e forse pi economicamente).

VETTORI  DI CLONAGGIO DIMENSIONI DELL'INSERTO
Plasmidi 0 -10 kb
Cosmidi 0 -20 Kb
Batteriofago P1 30 - 40 kb
BAC (cromosomi batterici artificiali) 70 - 100 Kb
PAC (cromosomi artificiali P1 ) 130 - 150 Kb
YAC (cromosomi artificiali di lievito) 0,2 - 2 Mb
MAC (cromosomi artificiali di mammifero) + di 1 Mb

 

 
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