Quanto è utile/interessante questa discussione:
| Autore |
Discussione |
|
|
LUCIA14976
Nuovo Arrivato
20 Messaggi |
 Inserito il - 02 giugno 2007 : 11:59:38
|
ciao a tutti, ho un problema, forse banalissimo, ma non riesco a vedere la soluzione. Come si normalizzano le quantità ottenute con una real-time? o meglio sto facendo la quantificazione assoluta, quindi per ogni gene (interesse ed HK) faccio uno standard e questo mi permette di sapere in che quantità sono espressi i due geni. logicamente a me serve di sapere solo le quantità del gene di interesse, ma mi sembra di capire che devo usare quelle dell'HK per normalizzare le prime. per odesso sono riuscita a capire che devo fare il rapporto tra (q)gene di interesse e (q)HK per ogni campione di cDNA. Però poi non riesco a capire cosa devo fare di questo valore. Ho pure trovato che dovrei fare la differenza tra questo rapporto per ogni cDNA e il rapporto ottenuto con il controllo negativo. Ma anche di questo dato non capisco cosa ne devo fare? posso utilizzarlo direttamente per costruire gli istogrammi?
|
|
|
|
|
chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 03 giugno 2007 : 01:21:39
|
Ciao! Innanzitutto benvenuta sul forum!
Allora, il tuo gene housekeeping ti serve per normalizzare rispetto alla quantità di DNA caricato.
Immagina questa situazione: hai controlli e trattati e nei trattati per qualsiasi motivo hai caricato più DNA o la reazione è andata meglio. Se il tuo trattamento non avesse alcun effetto e tu analizzassi solo il tuo gene di interesse arriveresti alla conclusione (errata) che il tuo trattamento aumenta quel gene, quando invece è semplicemente un problema tecnico.
La curva std ti serve per quantificare in assoluto (5 ng/ml o un valore di questo tipo) quanto DNA hai nel campione, ma non la puoi usare per confrontare due campioni. Per questo scopo si usa l'housekeeping.
L'housekeeping è un gene che NON deve essere modificato dal trattamento quindi, a patto di caricare la stessa quantità di DNA in tutti i campioni, sarà sempre uguale, almeno in teoria.
Diciamo che hai 2 controlli e 2 trattati e ottieni (valori a caso):
HK -> C1: 10 C2: 9.6 T1: 9.3 T2: 11.5
gene X -> C1: 1.5 C2: 1.48 T1: 3.05 T2: 3.27
Per normalizzare, in ciascun campione fai X/HK, questo ti dà la % di X rispetto ad HK. Ad es. per il campione 1 : 1.5/10 = 0.15, vuol dire che X è il 15% di HK.
Nota come, ad es. il C2, nonostante abbia un valore per X minore di C1, in realtà ne contiene di più! (1.48/9.6 = 0.154)!
Questi valori sono ipotetiche quantità di trascritto. Se usi i Ct devi fare la differenza e non la divisione perchè in quel caso stai lavorando su dei logaritmi.
Ora, come entra in tutto questo il controllo negativo? Il controllo negativo che di solito è solo acqua va sottratto perchè ti fa da bianco. Nel controllo negativo IN TEORIA la quantità di X e di HK è 0, ma in realtà a volte vedi un'amplificazione, generalmente dopo i 35-40 cicli.
Quindi, se la tua curva del negativo è piatta avrai HK=0 e X=0 e non te ne preoccupi.
Se invece hai qualcosa tipo HK=0.01 e X=0.0001 allora sottrarrai questi valori nei singoli campioni.
Quindi in C1 invece di fare 1.5/10 farai (1.5-0.0001)/(10-0.01) = 0.15014 che praticamente è lo stesso di prima, perchè i valori del bianco sono nel mio esempio molto bassi.
Ok, adesso hai tutti questi valori per controlli e trattati (che ti consiglio di caricare in triplicato), ne fai media ed errore std e fai il tuo bel grafico! :D |
Sei un nuovo arrivato?
Leggi il regolamento del forum e presentati qui
My photo portfolio (now on G+!) |
 |
|
|
LUCIA14976
Nuovo Arrivato
20 Messaggi |
Inserito il - 03 giugno 2007 : 11:56:30
|
| Grazie tante, è la prima volta che partecipo a questo forum e direi che non mi aspettavo una risposta tanto dettagliate e precisa. Grazie ancora, ora è decisamente tutto più chiaro |
|
|
|
LUCIA14976
Nuovo Arrivato
20 Messaggi |
Inserito il - 03 giugno 2007 : 12:12:21
|
....però ora mi viene un dubbio , dovrei sottrarre al mio geneX oltre all'eventuale amplificazione nel negativo, anche l'eventuale amplificazione che ci potrebbe essere nel corrispondente RNA!!! |
|
|
| |
Discussione |
|
|
|
Quanto è utile/interessante questa discussione:
| MolecularLab.it |
© 2003-18 MolecularLab.it |
|
|
|
Normalizzazione Real Time
Didattica
