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 A cosa servono gli ioni nel tampone dell'elettroforesi
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Tag   elettroforesi    tampone    ioni    tecniche  Aggiungi Tag

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Mendel
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Inserito il - 22 gennaio 2014 : 21:39:04  Mostra Profilo Invia a Mendel un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Mi spiego: l'elettroforesi è una tecnica che permette di separare molecole cariche quando applichiamo ad esse un campo elettrico. Per fare ciò viene aggiunto nella camera di separazione un tampone che presenta una certa quantità di ioni, e questi chiaramente verranno separati anch'essi tra di loro quando viene applicata la differenza di potenziale sopra citata.

Ecco, ma la domanda è questa: se a me interessa separare molecole cariche nel mio campione di analisi, a che mi serve aggiungere un tampone contenente altri ioni? La separazione delle molecole del campione non avviene lo stesso anche se non aggiungo questi ioni esterni del tampone di corsa?

chick80
Moderatore

DNA

Città: Edinburgh


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Inserito il - 23 gennaio 2014 : 07:48:43  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di chick80 Invia a chick80 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Cosa succede se fai passare della corrente attraverso dell'acqua distillata?

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Mendel
Nuovo Arrivato



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Inserito il - 23 gennaio 2014 : 13:03:42  Mostra Profilo Invia a Mendel un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ciao chick 80,
se io metto un elettrodo positivo ed uno negativo in acqua distillata non succede nulla perché non ci sono ioni in soluzione, ma se in questa soluzione avessi molecole cariche allora ci sarebbe corrente.

Ma il punto è proprio questo: se nel mio campione di analisi ho già molecole cariche (esempio DNA da separare), nel momento in cui applico una differenza di potenziale a questo campione, le molecole di DNA dovrebbero iniziare a migrare verso l'anodo.
Perché ciò non avviene se aggiungo un tampone senza ioni? Questi non fanno altro che migrare insieme alle molecole DNA, quale è il loro ruolo? Perché questi ioni sono cosi importanti ai fini della migrazione delle molecole cariche del mio campione?

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chick80
Moderatore

DNA

Città: Edinburgh


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Inserito il - 23 gennaio 2014 : 15:51:57  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di chick80 Invia a chick80 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Sì, ma il tuo campione è solo nel pozzetto del gel... ti serve che tutto l'ambiente attorno conduca la corrente, e che la conduca in maniera uniforme in tutti i punti del gel.

Inoltre il buffer, in quanto tale, permette di mantenere il pH costante.

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Mendel
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31 Messaggi

Inserito il - 23 gennaio 2014 : 16:11:58  Mostra Profilo Invia a Mendel un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Niente, proprio non ci capiamo, io domando a coppe e tu rispondi a mazze!

Ho capito che c'è sta corrente, ma mi spieghi perché mai è necessaria sta corrente di ioni del buffer per far muovere il mio campione???


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chick80
Moderatore

DNA

Città: Edinburgh


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Inserito il - 23 gennaio 2014 : 16:54:17  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di chick80 Invia a chick80 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
se la corrente non passa perchè invece del buffer metti dell'acqua distillata il tuo campione non può magicamente muoversi dal pozzetto.

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Mendel
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31 Messaggi

Inserito il - 23 gennaio 2014 : 19:07:17  Mostra Profilo Invia a Mendel un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Se metto acqua distillata in un campo elettrico il mio campione dovrebbe muoversi lo stesso se in esso ci sono molecole cariche (ad esempio il DNA)!

Capisci il mio dubbio adesso?
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chick80
Moderatore

DNA

Città: Edinburgh


11491 Messaggi

Inserito il - 23 gennaio 2014 : 19:30:46  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di chick80 Invia a chick80 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Il fatto è che per avere movimento di ioni devi chiudere il circuito.

Esistono sistemi di elettroforesi "dry", ma in quel caso gli elettrodi sono piantati nel gel, che è stato fatto in TBE ed è quindi conduttore...

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Mendel
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31 Messaggi

Inserito il - 24 gennaio 2014 : 00:59:49  Mostra Profilo Invia a Mendel un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Il concetto proprio non passa nella mia testa.

Io capisco quando dici che il circuito si deve chiudere, ma non comprendo perché il mio campione carico negativamente non migra se questo circuito lo "chiudo" con acqua distillata dato che in ogni caso c'è un polo positivo che attira il DNA carico negativamente del mio campione.

Possibile che non riesco a farmi capire? La corrente di cui tu parli può generarsi direttamente dal mio campione perché questo contiene molecole cariche.

Immagina ad esempio che io prenda una bacinella di acqua distillata e ci metta dentro tante molecole di DNA cariche negativamente, poi a questa bacinella collego due elettrodi di segno opposto, le molecole di DNA non cominceranno a migrare? E perché lo stesso non può avvenire nell'elettroforesi?
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chick80
Moderatore

DNA

Città: Edinburgh


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Inserito il - 24 gennaio 2014 : 07:43:00  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di chick80 Invia a chick80 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Perchè non puoi chiudere un circuito con acqua distillata. Se prendi dell'acqua distillata e ci metti dentro del DNA non hai più dell'acqua distillata, hai un mezzo conduttore e allora le tue molecole migreranno.

Questo NON è il caso nell'elettroforesi in cui il DNA non è sciolto nel tampone, ma è messo nel pozzetto del gel, quindi non hai un circuito continuo. Tra l'elettrodo e il DNA/gel che sono conduttori non c'è un mezzo conduttore.

Mettila così: prendi una lampadina e attaccaci due fili collegati ai poli di una batteria. La lampadina si accende. Adesso lascia un po' di spazio fra i fili e la lampadina. La lampadina non si accende più. Eppure hai una ddp tra i due fili ed un conduttore in mezzo.

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Mendel
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31 Messaggi

Inserito il - 24 gennaio 2014 : 15:32:58  Mostra Profilo Invia a Mendel un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Allora, è esatto quello che dici tu, ma potresti spiegarmi in dettaglio perché il mio campione inizia a migrare una volta chiuso il circuito con il buffer di ioni?

Una volta attaccati i due elettrodi che succede?

Prendiamo sempre l'esempio del DNA carico negativamente nel mio pozzetto, una volta attaccati gli elettrodi come fa il DNA a migrare verso l'elettrodo positivo?

Tu mi dirai che ciò avviene perché le cariche negative sono attratte dal polo positivo. Ok giusto, ma questa attrazione tra DNA ed elettrodo positivo non ci sarebbe anche se non ci fossero gli ioni del buffer? Cioè il campo elettrico generato dall'elettrodo positivo non è sufficiente per far migrare il mio campione? Perché tra il gel e l'elettrodo ci deve per forza stare questo buffer ricco di ioni affinché avvenga la migrazione del mio DNA? Si ok, il buffer serve per chiudere il circuito e generare la corrente, ma perché questa corrente di ioni dovrebbe far muovere il mio campione??? Secondo quale principio fisico o chimico avviene ciò???

Per favore, spiegami bene nel dettaglio questo punto perché sto impazzendo!
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chick80
Moderatore

DNA

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Inserito il - 25 gennaio 2014 : 12:22:30  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di chick80 Invia a chick80 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Urca, mi chiedi di togliere un po' di ruggine dai miei ricordi di elettromagnetismo! :D

Prova a vedere se queste pagine possono chiarirti le idee:

http://chemwiki.ucdavis.edu/Physical_Chemistry/Kinetics/Complex_Reactions/Ionic_Mobility_and_Electrophoresis

Citazione:
The electric field’s properties determine the separation of ions, and is affected by resistance, current, and voltage. The higher the current, the faster the migration of the ions (due to increased Coloumbic attractions). Since the current is affected by voltage, as the difference in potential between the electrodes increases, the rate of migration increases.


http://www.intechopen.com/download/get/type/pdfs/id/35088

Citazione:
Electrophoresis Buffer: Several different buffers have been recommended for electrophoresis of DNA. The most commonly used for duplex DNA are TAE (Tris-acetate-EDTA) and TBE (Tris-borate-EDTA). DNA fragments will migrate at somewhat different rates in these two buffers due to differences in
ionic strength. Buffers not only establish a pH, but provide ions to support conductivity. If you mistakenly use water instead of buffer, there will be essentially no migration of DNA in the gel! Conversely, if you use concentrated buffer (e.g. a 10X stock solution), enough heat may be generated in the gel to melt it.


Vedo se riesco a trovare una spiegazione più completa dal punto di vista fisico...

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