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BotryGen
Nuovo Arrivato
8 Messaggi |
 Inserito il - 29 settembre 2008 : 18:17:08
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Ciao, problema:
faccio una PCR con primer specifici per amplificare un mRNA retrotrascritto e ottengo più di una banda.
Pensavo fosse aspecifico e così ho aumentato la Tm.
Ma rimangono le bande.
Da cosa può dipendere secondo voi?
Grazie
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Patrizio
Moderatore
Città: Barcellona
1912 Messaggi |
Inserito il - 29 settembre 2008 : 18:26:33
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che amplifichi anche gli altri cDNA .... |
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morgan79
Utente Junior
Prov.: Bari
143 Messaggi |
Inserito il - 29 settembre 2008 : 18:51:23
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| é assolutamente normale avere sottoprodotti in una reazione di PCR, non per niente esistono i marker e i kit di estrazione di DNA da gel di agarosio |
il sapere non è sufficiente, bisogna applicare; il volere non è sufficiente, bisogna fare |
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Ale 80
Nuovo Arrivato
Città: Napoli
10 Messaggi |
Inserito il - 29 settembre 2008 : 20:18:12
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| Hai provato con una Taq ad alta specificità?? La Roche ne ha una che si chiama Fast Start. Consulta il catalogo, è ottima e ti toglie tutti gli aspecifici |
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Patrizio
Moderatore
Città: Barcellona
1912 Messaggi |
Inserito il - 29 settembre 2008 : 20:31:23
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ahahahaaha scusa ma che taq e'?
ha gli occhi ??...non e'che specificita' sta per affidabilita' della polimerizzazione?
e poi da voci di "corridoio" mi dicono che quelli della Roche vendono la Taq a un prezzo esorbitante! |
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Patrizio
Moderatore
Città: Barcellona
1912 Messaggi |
Inserito il - 29 settembre 2008 : 20:49:07
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Citazione:
Messaggio inserito da morgan79
é assolutamente normale avere sottoprodotti in una reazione di PCR, non per niente esistono i marker e i kit di estrazione di DNA da gel di agarosio
Be onestamente ... non e' che sia tanto normale
e quando fai la real time che fai leggi tutto ?,nel tuo caso va bene se la devi eluire da gel...ma non dev essere una normalita' .... diciamo un caso |
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RM
Nuovo Arrivato
115 Messaggi |
Inserito il - 29 settembre 2008 : 20:57:16
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| Può essere uno splicing alternativo. O contaminazione da DNA. Dipende dal design dei primer. Puoi dare maggiori informazioni? |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 29 settembre 2008 : 21:36:53
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Beh tanto normale non sembra neanche a me, i primers dovrebbero essere disegnati in modo che non ci siano aspecifici, anche se può capitare che ne saltino fuori.
Che poi con una bella eluizione si possa risolvere non è in dubbio, però se si ha una PCR pulita è sicuramente meglio.
(nel caso di una real-time con ad es. come fa notare Patrizio sarebbe impensabile quantificare in presenza di aspecifici)
Come già detto potrebbe essere contaminazione da DNA, hai controllato con una blast a cosa si attaccano i primers? Nel caso si attaccassero anche al DNA che banda otterresti? Una che ti viene fuori? Sei sicuro che i primers non si leghino anche in altri punti del tuo cDNA?... i casi sono tanti
A volte semplicemente una coppia di primers funziona male e ridisegnando una nuova coppia tutto funziona. |
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morgan79
Utente Junior
Prov.: Bari
143 Messaggi |
Inserito il - 29 settembre 2008 : 22:39:27
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| nel caso della realtime i primer sono scelti con tutti i sentimenti, nel caso di amplificazione di cDNA i primer sono costretti dal codone di inizio e il codone di fine.... poi non so che ci devi fare, se lo devi esprimere (come capita sempre a me quando amplifico cDNA) va bene come dico io, se devi fare altre indagini, allora cambia coppia di primer |
il sapere non è sufficiente, bisogna applicare; il volere non è sufficiente, bisogna fare |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 29 settembre 2008 : 22:51:32
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Citazione:
Messaggio inserito da morgan79
...nel caso di amplificazione di cDNA i primer sono costretti dal codone di inizio e il codone di fine....
No aspetta morgan... forse ci siamo persi un pezzo!
Nel post iniziale si parlava di: "amplificare un mRNA retrotrascritto"
senza specificare se fosse l'amplificazione di tutto il CDS ad es. per un clonaggio. In questo caso saresti costretto dai codoni di inizio e fine altrimenti no! (a parte che anche in questo caso a volte basta modificare leggermente i primers e si ottengono bande specifiche, ma ovviamente ogni caso è a se).
Comunque non è stato specificato che amplificazione è stata fatta e a quale scopo, bisognerebbe avere maggiori dettagli in proposito.
In ogni caso un bel blast anche se non risolve tutti i problemi è sempre il caso di farlo. E anche assicurarsi che non si tratti di DNA.
Poi come detto prima una bella eluizione risolve sicuramente il problema! |
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morgan79
Utente Junior
Prov.: Bari
143 Messaggi |
Inserito il - 30 settembre 2008 : 10:41:46
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| vabbé io ho risposto in base alla mia esperienza professionale.... poiché amplifico i cDNA per esprimere, credimi, non é raro trovarsi di fronte a PCR multibanda |
il sapere non è sufficiente, bisogna applicare; il volere non è sufficiente, bisogna fare |
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BotryGen
Nuovo Arrivato
8 Messaggi |
Inserito il - 30 settembre 2008 : 14:28:15
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Allora, avete ragione, sarò più specifico.
Ho disegnato due primer su start e stop per vedere se in una libreria in mio possesso ci fosse il mio gene di interesse.
Il desiderio sarebbe poi clonare il prodotto di PCR per fare sonde ad RNA per in situ ed espressione.
La mia perplessità è che ho 3 bande.
Una di 1000 pb, non attesa.
Una di 1800 pb, attesa.
Una di 3000 pb, non attesa.
Potrei spiegarmi il tutto con dell' aspecifico, ma le tre bande sono nette.
Per caso qualcuno di voi ha esperienza con le HSP?
Magari possono essere simili e quindi trovo diversi messaggeri. |
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Neuroscience
Utente
659 Messaggi |
Inserito il - 30 settembre 2008 : 16:55:04
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BotryGen,
i consigli che ti possiamo dare dipendono anche da che vuoi vedere, poiché se devi fare un semplice clonaggio, basta ritagliare la banda da gel e ti cloni il cDNA in un vettore, e te ne freghi del resto. Se invece devi avere per forza una sola banda, allora puoi procedere a quanto segue.
1) verifica se le altre bande provengono dallo stesso cDNA di tuo interesse (per splicing alternativo o forte omologia) puoi estrarre ogni singola banda e fare una nested (PCR sulle singole bande ottenute con primers più interni di quelli che hai usato), se sono tutte positive allora significa che tutte queste bande sono il tuo cDNA in diverse forme.
2) se solo 1 banda è specifica puoi aumentare la temperatura di annealing, aggiungere DMSO, formaldeide, oppure diminuire la concentrazione di primers per rendere la reazione più stringente e quindi favorire la banda specifica.
3) se comunque non va bene, cambia coppia di primers e scegliti un'altra zona.
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E. Coli
Nuovo Arrivato
22 Messaggi |
Inserito il - 30 settembre 2008 : 20:59:12
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io come al solito concordo con morgan79...cmq non capisco dove sia il prioblema: hai delle multibande, carichi una buona quantità di prodotto di PCR su gel, fai separare bene e estrai da gel (il kit della Sigma è sen sa zio na le!)...io faccio così e fino ad oggi è tutto ok... (almeno spero)
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Ale 80
Nuovo Arrivato
Città: Napoli
10 Messaggi |
Inserito il - 30 settembre 2008 : 21:46:09
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simpaticissima la tua risposta ma forse non hai esperienza sufficiente... con una laurea ed un dottorato di ricerca all'attivo mi sento in dovere di correggerti... la Fast Start di cui sopra è una Taq ad ALTA SPECIFICITA' (fino a prova contraria la terminologia scientifica la conosco bene) e io la uso da svariati anni con successo ogni volta che ho problemi di aspecifici. probabilmente avrà anche occhi bocca e naso ma funziona. Se poi è un problema economico quello dipende dai fondi che si hanno a disposizione
Citazione:
Messaggio inserito da Patrizio
ahahahaaha scusa ma che taq e'?
ha gli occhi ??...non e'che specificita' sta per affidabilita' della polimerizzazione?
e poi da voci di "corridoio" mi dicono che quelli della Roche vendono la Taq a un prezzo esorbitante!
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Patrizio
Moderatore
Città: Barcellona
1912 Messaggi |
Inserito il - 30 settembre 2008 : 22:25:22
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Citazione:
Messaggio inserito da Ale 80
simpaticissima la tua risposta ma forse non hai esperienza sufficiente... con una laurea ed un dottorato di ricerca all'attivo mi sento in dovere di correggerti...
http://www.roche-applied-science.com/PROD_INF/BIOCHEMI/no4_03/PDF/p20_22.pdf
Innanzitutto ti dico che io sono un viceaiutantepelapatate del dipartimento nonche' un tesista,
pero', ti consiglio di leggerti il pdf cosi' magari fai bella figura con i tuoi colleghi,questa e' una taq uscita nel 2000 ...ben 8 anni FA !!! ,e non e' altro che una hotstart,sinceramente....dai retta a me....gli aspecifici,non si eliminano sempre con una semplice HOT-START PCR
a .... non hai idea del cazziatone che ti saresti presa nel mio lab se non avessi saputo come funziona la tua taq !! vero
e' il primers il pilota la polimerasi il motore |
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BotryGen
Nuovo Arrivato
8 Messaggi |
Inserito il - 01 ottobre 2008 : 11:01:48
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dai dai su, esco un attino dal seminato...
Per separare in gel due bande vicine, diciamo sui 500 e 550 pb, che gel mi consigliate, a che %?
Per aumentare la risoluzione sto facendo gel grandi, ma il mio dubbio è: aumento la % o diminuisco?
Di base faccio un 1%.
Graaaazie....
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Patrizio
Moderatore
Città: Barcellona
1912 Messaggi |
Inserito il - 01 ottobre 2008 : 11:39:05
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ehehe..no tranquillo io mi diverto
dovresti aumentare la [ ] dell agar...solo che non so se hai un marker adatto perche' altrimenti la [ ] di agarosio dipende anche da questo ,cmq portalo al 1,8% - 2% e fallo correre mooolto lentamente |
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mollichina di pane
Utente Junior
121 Messaggi |
Inserito il - 01 ottobre 2008 : 21:35:55
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ehm...scusate se mi permetto  ...
in caso di aspecificità, botrygen potrebbe provare anche una touch down. Questa dovrebbe ridurre il problema! Anche se in questo caso, come gli avete consigliato, gli basta tagliare la banda ed eluirla.
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Patrizio
Moderatore
Città: Barcellona
1912 Messaggi |
Inserito il - 01 ottobre 2008 : 21:42:40
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Citazione:
Messaggio inserito da mollichina di pane
ehm...scusate se mi permetto ...
in caso di aspecificità, botrygen potrebbe provare anche una touch down. Questa dovrebbe ridurre il problema! Anche se in questo caso, come gli avete consigliato, gli basta tagliare la banda ed eluirla.
dipende da quanto e' intenso l aspecifico se e' al pari della banda io direi che non funziona...poi...tutto e' possibile
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Anyra
Utente Junior
Prov.: Pesaro-Urbino
Città: Saltara
212 Messaggi |
Inserito il - 02 ottobre 2008 : 13:07:02
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Ma se le bande sono poi così nette dubito che siano poi cos' aspecifiche.
Concordo con il mago Patrizio riguardo la hot start ed io ho la laurea, il dottorato e pure un master in biotecnologie, per quanto possano sevire 
A parte le polemiche e tutto il resto Se non hai fretta prova ad allungare i primers specie quelli di start.
Se hai la possibilità di riestrarre l'RNA prova a fare un trattamento con la DNAse per eliminare il DNA contaminante.
Porta al massimo la T di aneaking e se ci riesci prova a confrontare 2 o più diverse [ ] di MgCl2 (da 2 mM a 5 mM cf)
in bocca al lupo
PS carina la metafora del motore e del pilota! posso rivendermela con i miei studentelli? |
Il mio Cavaliere
http://s4.battleknight.it/index.php?loc=hire&ref=OTA3NTAw |
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Patrizio
Moderatore
Città: Barcellona
1912 Messaggi |
Inserito il - 02 ottobre 2008 : 15:59:35
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Citazione:
Messaggio inserito da Anyra
PS carina la metafora del motore e del pilota! posso rivendermela con i miei studentelli?
eheheh ma siii fai pure
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Discussione |
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Problema multi banda con PCR
Didattica
